Диссертация (1139719), страница 42
Текст из файла (страница 42)
92). Подобный максимум при длине волны 413±2 нм характерен для комплекса рутина со спиртовым раствором алюминия хлорида, используемого обычно в качестве стандартного образца (рис. 92).Наиболее стабильные результаты, согласно литературным данным, получаются при использовании в качестве комплексообразователя 2% спиртового раствора алюминия хлорида всоотношении экстракт-реагент 1:1 [18, 133,216,241,347,356,357,373]. Известно также, что время,в течение которого окраска образующегося комплекса является устойчивой, может варьироватьв зависимости от объекта исследования. В связи с этим необходимо выявить промежуток времени, в течение которого окраска комплекса алюминия с извлечением из плодов облепихи будет оставаться стабильной (риc. 93).0,6оптическая плотность120,430,20350450550650длина волны, нмРис.
92. Спектры поглощения (1 - спектр поглощения 0,0004 % спиртового раствора стандартного образца рутина; дифференциальные спектры поглощения комплексов рутина (2) иизвлечения из плодов облепихи (3) с алюминия хлоридом)213Рис. 93 показывает, что стабильная окраска комплекса достигается к 20 минутенаблюдений и сохраняется до 30 минут. В таблице 134 представлены данные по влияниюсостава экстрагента на степень извлечения флавоноидов (в пересчете на рутин) из плодовоблепихи.
Как видно из таблицы 134, лучшим экстрагентом для выделения флавоноидов изплодов облепихи является 70 % этанол, что совпадает с данными литературы [18,133,215,241,347,356,357,373].Рис. 93. Зависимость оптической плотности комплекса алюминия с извлечением из плодовоблепихи от времениТаблица 134Зависомость извлечения флавоноидов из плодов облепихи от состава экстрагента [183]№ п/пЭкстрагентСодержание флавоноидов, %196 % этанол0,620±0,0689270 % этанол1,085±0,1206340 % этанол0,687±0,07624Вода0,677±0,0753Оптимальным для извлечения флавоноидов является соотношение сырья и экстрагента1:30 (таблица 135), а наилучшее время экстракции - 45 минут (рис.
94) [34,172,183].Содержание флавоноидов, %1,210,80,62530354045505560Время экстракции, минРис. 94. Диаграмма зависимости содержания флавоноидов в извлечении отвремени экстракции214Таблица 135Результаты определения суммы флавоноидов в извлечениях из плодов при различном соотношении сырья и экстрагента [183]№ п/пЛРС-экстрагентНайдено флавоноидов, %11:200,314±0,034921:301,085±0,120631:500,362±0,0403Количественное определение. Около 2 г измельченных плодов (т.н.) экстрагируют в конической колбе объемом 250 мл с 60 мл 70% этанола на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин, предварительно взвешивая с погрешностью ±0,01 г.
Колбу послеохлаждения взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы 70% этанолом. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата. 2 млизвлечения переносят в мерную колбу объемом 25 мл, добавляют 2 мл 2% раствора алюминияхлорида в 70% этаноле и через 10 мин — 1 каплю разведенной уксусной кислоты. Объем доводят тем же спиртом до метки и оставляют на 20 мин. Оптическую плотность раствора измеряютна спектрофотометре при длине волны 413±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительнораствора сравнения (2 мл извлечения, 1 капля разведенной уксусной кислоты и 70% этанол, добавленный до метки в мерной колбе объемом 25 мл). Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО рутина, обработанного аналогично испытуемому образцу. Содержаниесуммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляютпо формуле 19:ХАх m0 1 100 600 100A0 m 2 50 (100 W )Ax m0 6000A0 m (100 W )(19)где А — оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора РСОрутина; m — масса сырья, г; m0 — масса РСО рутина, г; W — потеря в массе при высушиваниисырья, %.Примечание.
Приготовление раствора стандартного образца рутина осуществляли какописано в Главе 2.Данные статистической обработки результатов определения суммы флавоноидов в плодахоблепихи по разработанной методике приведены в таблице 136.Таблица 136Метрологическая оценка методики определения суммы флавоноидов в плодах (P = 95 %; n = 4)xсрS2SSxcp∆x∆xcpεср, %1,085 0,00577 0,0759 0,037950,240,120611,12215Результаты определения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчётена рутин в свежих, высушенных и замороженных плодах через 3, 6 и 9 месяцев хранения представлены в таблице 137.Таблица 137Результаты определения суммы флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной (в пересчетена абсолютно сухое сырье) [125]№ п/пАнализируемые плодыНайдено флавоноидов, %1Плоды свежие1,085±0,12072Плоды высушенные0,550±0,06123Плоды замороженные (3 мес.)0,990±0,11014Плоды замороженные (6 мес.)0,700±0,08005Плоды замороженные (9 мес.)0,665±0,0740Данные таблицы 137 показывают, что при хранении плодов облепихи в различных условиях происходит снижение содержания флавоноидов, что вероятно можно объяснить их высокой реакционной способностью в окислительно-восстановительных процессах.
Замораживаниедо 3 месяцев не приводит к достоверному снижению количества данной группы БАВ. При хранении в условиях заморозки до 9 месяцев отмечается уменьшение содержания суммы флавоноидов примерно в 2 раза, что согласуется с данными ТСХ-анализа (таблица 137).5.3.2.3. Исследование фенольной фракции плодов методом ВЭЖХ-МСАнализ и пробоподготовку осуществляли, как описано в Главе 2 (п. 2.2.11). В плодах облепихи обнаружены флавонолгликозиды – производные кверцетина, кемпферола и изорамнетина, основными из которых были изорамнетин-3-рутинозид (18,2% от суммы флавоноиов),изорамнетин-3-софорозид-7-рамнозид (13,1%) и изорамнетин-3-глюкозид-7-рамнозид (12,6%)(рис.
95). Спектр поглощения преобладающего в исследуемых плодах облепихи флавоноида –изорамнетин-3-рутинозида представлен на рисунке 96. Результаты ВЭЖХ-МС-ДМД анализаспецифического профиля флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной представлены в таблице 138.Суммарное содержание флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной составило2,217 мг/г (в пересчете на абсолютно сухое сырье). Среди минорных соединений идентифицированы 3-рутинозид-7-рамнозиды изорамнетина, кверцетина и кемпферола, 3-софорозид-7рамнозиды кверцетина и кемпферола, рутин, 3-глюкозид и 3-рамнозид изорамнетина. Полученные результаты соответствуют литературным данным о профиле флавоноидов облепихи крушиновидной [383,408,423].216Рис.
95. Хроматограмма извлечения из плодов облепихи крушиновидной при λ=350 нм.Номера пиков флавоноидов на хроматограмме соответствуют номерам в таблице 138Рис. 96. Спектр поглощения изорамнетин-3-рутинозидаТаблица 138Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС анализа профиля флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной№ФлавоноидК* ESI-MS+,Детектируемый ионλmax, Содержаm/zнмние, мг/г1234567+1Кверцетин-32,95 773.27,[M+H]256,0,21софорозид-7611.21,[M – глюкоза** + Н]+266,рамнозид,449.16,[M – софороза + Н]+354Сирингетин333.18,[M – гликозид + Н]+гликозид303.17[M – софороза – рамноза + Н]+2Кверцетин-33,14 757.28258,0,14[M+H]+рутинозид-7303.17266,[M – рутиноза – рамноза + Н]+рамнозид360+3Кемпферол-3- 3,19 757.28,[M+H]266,0,15софорозид-7595.22,[M – глюкоза + Н]+346рамнозид433.16,[M – софороза + Н]+287.09[M – софороза – рамноза + Н]+4Кверцетин-33,22 787.29,[M+H]+254,0,17рутинозид-7641.23,[M – рамноза + Н]+266,217156782глюкуронидИзорамнетин-3софорозид-7рамнозидИзорамнетин-3рутинозид-7рамнозид33,29254,266,3524,12771.29,625.23,463.17,317.10[M+H]+[M – рамноза + Н]+[M – рутиноза + Н]+[M – рутиноза – рамноза + Н]+255,270, 366741.28,595.22-254,266, 3580,12625.23,463.17,317.10611.21,465.15,303.09625.23,479.17,317.10479.17,317.10463.17,317.10[M+H]+[M – глюкоза + Н]+[M – глюкоза – рамноза + Н]+[M+H]+[M – рамноза + Н]+[M – рутиноза + Н]+[M+H]+[M – рамноза + Н]+[M – рутиноза + Н]+[M+H]+[M – глюкоза + Н]+[M+H]+[M – рамноза + Н]+254,266, 3520,28256,266, 3560,14254,266, 3560,41317.10[M+H]+Рутин4,5010Изорамнетин-3рутинозид5,061213Изорамнетин7[M+H]+[M – глюкоза + Н]+[M – софороза + Н]+[M – софороза – рамноза + Н]+Неидентифицированный флаво- 4,17нолгликозидИзорамнетин-3глюкозид-74,22рамнозидИзорамнетин-3глюкозидИзорамнетин-3рамнозид6352787.29,625.23,463.17,317.1091145479.17,[M – рутиноза + Н]+303.17 [M – рутиноза – глюкур.
к-та + Н]+5,447,128,84254,266, 356254,270, 370254,270, 3720,300,110,140,060,02Сумма флавоноидов2,25*Коэффициент емкости; **Гликозидный остаток, представляющий собой молекулярную массуминус 18 Да (молекула воды, теряющаяся при образовании гликозидной связи).В ряде исследований [383,408,423] среди препаративно-выделенных из плодов и листьевоблепихи флавоноидов методом 1Н и 13С ЯМР идентифицированы 7-О-α-L-рамнозиды изорамнетина, кверцетина и кемпферола, имеющие различные гликозидные остатки в положении С-3,преимущественно софорозиды, рутинозиды и глюкозиды. Присутствие в облепихе кверцетин-3рутинозид-7-глюкуронида отмечено нами впервые.5.3.3.
Определение аминокислот в свежих, замороженных и высушенных плодах облепихикрушиновиднойПредварительный качественный скрининг на присутствие АК проводили со спиртовымраствором нингидрина. Появление фиолетового окрашивания в извлечении из исследуемогоЛРС указывало на наличие АК [251]. Ранее методом ТСХ при помощи разработанных методик218разделения и идентификации АК в растительных объектах (Глава 4, п. 4.4.1 и 4.4.2) с применением двумерного и однократного хроматографирований в извлечении из плодов облепихи крушиновидной были идентифицированы АК в сравнении с достоверными стандартными образцами [119,120].Для количественного определения АК в плодах облепихи крушиновидной за основу взята унифицированная, запатентованная методика, разработанная Т.И.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
