Диссертация (1139719), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Содержание суммыАЦ в свежих плодах облепихи крушиновидной в пересчете на абсолютно сухое сырье при этомоптическая плотностьсоставило 0,60% [307].21,81,61,41,210,80,60,40,2021200300400длина волны, нм500600700Рис. 88. Спектры поглощения извлечений из плодов облепихи крушиновидной: 1 - полученногос применением 80% подкисленного спирта относительно экстрагента; 2 - полученного послеразведения аликвоты 2,5% спиртовым раствором аммиака относительно растворителяоптическая плотность2070,50,40,30,2длина волны, нм0,10200300400500600700Рис. 89.
Дифференциальный спектр поглощения извлечения из плодов облепихи крушиновиднойСогласно полученным данным, метод с аммиаком имеет среднюю относительную ошибку ±9,97%, что меньше средней относительной ошибки метода рН-дифференциальной спектрофотометрии (более 15,0%), и характеризуется простотой выполнений. Однако, метод имеет некоторые недостатки, по сравнению с прямым спектрофотометрическим определением суммыАЦ.Во-первых, развивающаяся окраска после добавления 2,5% раствора аммиака в 80% этиловом спирте нестабильна во времени (измерение нужно проводить ровно через 1 минуту), и,как следствие, во-вторых, средняя ошибка определения примерно в 3 раза больше [307].5.3.1.3.
Разделение антоциановых соединений плодов облепихи крушиновидной методомТСХВопросам, посвященным разделению и идентификации АЦ методом ТСХ, в научной литературе уделено значительное внимание [1,108,121,151,155,209]. В эксперименте изучено более пятнадцати типов элюирующих систем в диапазоне полярности от 4,79 до 6,68 (P) [266](таблица 129), предложенных в литературе [1,108,121,151,155,209], а также подобранных самостоятельно. Хроматографированию подвергали 40-50 мкл извлечения, полученного, как описано ранее.
Просмотр зон осуществляли в видимом свете.Так как в системах № 8-17 (таблица 129), рекомендованных в литературе [1,108,121,151,155,209] разделения зон АЦ не наблюдалось, для дальнейших расчетов их не использовали. Вэлюентах № 1-7 обнаруживались 4 зоны АЦ, имеющих характерное окрашивание в видимомсвете. На хроматограммах для каждой элюирующей системы были рассчитаны такие хроматографические параметры зон АЦ, как величина Rf; коэффициенты распределения (K) и селективности сорбции [39] (таблица 130).208Таблица 129Элюенты, использованные для изучения возможности разделения АЦ плодов облепихи крушиновидной [220]№ЭлюентP№ЭлюентPп/пп/п1Б-У-В (4:1:5)6,689Э-У-В (70:15:15)5,292Б-У-В (4:1:2)5,6910В-конц.
HCl (97:3)3А-У-В (2:1:1)5,6011В-МК-конц. HCl (3:5:2)4Б-У-В (4:1:1)5,1312У-конц. HCl-В (3:1:8)5Б-У-В (4:1:3)6,1013Э-МК-В (80:8:12)5,086Б-У-В (4:1:4)6,4214В-УК-конц. HCl (82:15:0,3)7Б-У-В (4:1:0,5)4,7915В-УК-конц. HCl (10:30:3)8Э-У-В (55:25:25)5,8716Э-УК-МК-В (100:10:10:26)4,9717Х-Эт-В (26:16:3)4,99Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Х – хлороформ; Б – бутанол; Эт – этанол; МК – муравьиная кислота; А – амиловый спиртДля разделения АЦ плодов облепихи крушиновидной могут быть использованы системы№ 1,2,5,6. Однако, наилучшее разделение хроматографических зон АЦ, по данным таблицы130, было получено в системе № 1, так как величина коэффициента селективности сорбциипревышает 1,50.
Полученные хроматограммы разделения суммы АЦ плодов изображены нарис. 90.Таблица 130Эффективность разделения зон АЦ плодов облепихи в использованных элюентах [220]№ зоны1Rf±0,02212340,200,470,670,8312340,240,390,530,6612340,200,530,590,7912340,060,420,480,53К3LОкраска зон на хроматограммах45№ 1: Б-У-В (4:1:5)3,88красная1,13голубовато-синяя3,430,49голубовато-синяя2,310,21желтая2,39№ 2: Б-У-В (4:1:2)3,17красная1,562,03голубовато-синяя0,891,75голубовато-синяя0,521,71желтая№ 3: А-У-В (2:1:1)4,00красная0,894,49голубовато-синяя0,691,29голубовато-синяя0,272,56желтая№ 4: Б-У-В (4:1:1)15,67красная1,3811,36голубовато-синяя1,081,28голубовато-синяя0,891,21желтая№ 5: Б-У-В (4:1:3)2091123420,260,470,660,8012340,220,340,600,7512340,350,470,510,6332,851,130,520,2545красная2,52голубовато-синяя2,17голубовато-синяя2,08желтая№ 6: Б-У-В (4:1:4)3,55красная1,941,83голубовато-синяя0,672,90голубовато-синяя0,332,03желтая№ 7: Б-У-В (4:1:0,5)1,86красная1,131,65голубовато-синяя0,961,18голубовато-синяя0,591,63желтаяРис.
90. Вид хроматограммы разделения суммы АЦ плодов облепихи крушиновидной в системеБУВ (4:1:5)Таким образом, проведено разделение суммы АЦ плодов облепихи крушиновидной методом ТСХ. По совокупности полученных результатов были выбраны и теоретически обоснованы оптимальные условия разделения АЦ в тонком слое: сорбент - пластинки силикагелевыемарки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А; элюент – Б-У-В (4:1:5); объем пробы - 40 мкл извлечения, полученного с применением 80% подкисленного этанола; время насыщения камеры парами элюента- 30 минут; время элюирования - 1 ч.5.3.2. Исследование состава флавоноидов в плодах облепихи крушиновидной5.3.2.1.Разделение и идентификация флавоноидов методом ТСХФлавоноиды в плодах облепихи согласно НД не определяют. Однако флавоноидсодержащие растения привлекают внимание исследователей вследствие их перспективности в получе-210нии ЛП широкого спектра действия.
Поэтому стандартизация плодов облепихи по содержаниюфлавоноидов является весьма актуальной.Качественный анализ на присутствие флавоноидов проводили методом ТСХ по разработанной ранее методике (Глава 3, п. 3.2.1). Вид хроматограммы извлечения из плодов облепихи вУФ-свете после проявления 10 % спиртовым раствором NaOH представлен на рис. 91. Оптимальный объём пробы составил 100 мкл раствра, приготовленного для количественного определения. При нанесении 70 и 100 мкл пробы на хроматограммах извлечения из свежих плодовоблепихи (таблица 131) наблюдали 7 зон (Rf составило 0,08; 0,19; 0,32; 0,53; 0,64; 0,8; 0,99).При нанесении 30 и 40 мкл извлечения обнаруживалось пять хроматографических зон.Следует отметить, что дальнейшая обработка хроматограмм была затруднена, так как зоныимели нечёткий вид.
Сравнение величин Rf полученных хроматографических зон со стандартными образцами, позволило идентифицировать флавоноиды: рутин (Rf=0,53±0,02), гиперозид(Rf=0,64±0,02) и кверцетин (Rf=0,8±0,02), а также каротиноид - β-каротин (Rf=0,99±0,01). Неидентифицированные зоны вероятнее всего относятся к флавоноидам, так как имеют характерное свечение в УФ-свете.12345Рис. 91. Хроматограмма извлечения из плодов облепихи (точка 1 – 100 мкл извлечения; точка 2– 5 мкл 0,1 % стандартного спиртового раствора рутина; точка 3 – 3 мкл 0,1 % стандартногоспиртового раствора кверцетина; точка 4 – 5 мкл 0,1% стандартного спиртового раствора гиперозида; точка 5 - 10 мкл 0,1 % стандартного спиртового раствора β-каротинаРезультаты идентификации зон на полученных хроматограммах извлечения из плодов облепихи представлены в таблице 132.
Для каждой хроматографической зоны были рассчитанывеличины селективности сорбции (L) и коэффициент распределения (К) (таблица 132). Результаты показали удовлетворительное разделение хроматографических зон флавоноидов и правомерности использования данной методики.211Таблица 131Идентификация зон на хроматограммах извлечения из плодов облепихи свежих [182]Значение Rf№ Объем извле- неидентифип/п чения, мкл цированныерутингиперозидкверцетин β-каротинзоны0,13±0,02;1300,24±0,02;0,63±0,020,76±0,022400,40±0,0230,08±0,02;700,19±0,02;0,54±0,020,64±0,020,80±0,020,99±0,0141000,32±0,02Таблица 132Результаты оценки эффективности разделения зон БАВ на хроматограммеизвлечения из свежих плодов (рис. 91, точка 1) [182]№ зоныRf ±0,02KL = К1/К21 – неидентифицированная зона0,0811,52,672 – неидентифицированная зона0,194,302,023 – неидентифицированная зона0,322,1252,404 – рутин0,540,8871,585 – гиперозид0,640,56252,256 – кверцетин0,800,25257 – β-каротин0,99±0,010,01Вид хроматограммы извлечения из высушенных плодов облепихи характеризовался отсутствием четкого разделения зон флавоноидов, что можно объяснить окислительными процессами в сырье при повышенных температурах и контакте с кислородом воздуха во время сушки.На хроматограмме вытяжек из замороженных плодов облепихи через 3, 6 и 9 месяцев хранения(таблица 133) при нанесении 100 мкл пробы визуализировалось 6 зон.
Полученные данные(таблиц 133) свидетельствуют о снижении содержания флавоноидов при хранении плодов вусловиях заморозки.Таблица 133Идентификация зон на хроматограмме извлечения из плодов облепихи, консервированных способом заморозки [182]Значение RfВремя№хранения, неидентифицип/прутингиперозид кверцетинβ-каротинмес.рованные зоны130,16±0,02;0,38±0,020,53±0,020,64±0,020,80±0,020,99±0,012639Тем не менее, возможно дальнейшее использование плодов, консервированных способомзамораживания, для получения лекарственных препаратов на их основе, так как сохраняются212такие важнейшие представители данного класса БАВ, как рутин, гиперозид, кверцетин и др., атакже β-каротин.Разработанная ТСХ-методика, позволяет проводить полуколичественное определение рутина в общей сумме флавоноидов в извлечении из плодов облепихи свежих (Глава 3, п.
5.4.2).Полученная на хроматограмме извлечения зона рутина (рис. 91, точка 1) по величине иинтенсивности окраски соответствовала аналогичной хроматографической зоне на калибровочной хроматограмме стандартных растворов рутина. Результаты свидетельствуют, что содержание рутина в общей сумме флавоноидов извлечения составляет около 0,05%.5.3.2.2. Количественное определение суммы флавоноидов методом дифференциальнойспектрофотометрииДля количественного определения флавоноидов в сырье облепихи разработана методика,основанная на их способности взаимодействовать со спиртовым раствором алюминия хлорида собразованием окрашенного комплекса [18,133,215,241,347, 356,357,373] с аналитическим максимумом поглощения при длине волны 410±2 нм (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
