Диссертация (1139658), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Низкомолекулярныйсекретируемый белок ESAT6 [480] кодируется в регионе RD1, которыйприсутствует в M. tuberculosis и M. bovis, но отсутствует в M. bovis BCG. Средифакторов, которые оказывают непосредственное воздействие на организм хозяинадля подавления защитных механизмов, рассматривался именно белок ESAT6.Предполагается, что он участвует в лизисе мембран фаголизосом и внешнеймембраны макрофагов и тем самым способствует распространению микобактерийот одной клетки хозяина к другой [210; 226; 375]. A. Demissie с соавт. (2006)показали, что иммунные ответы на ESAT6 вероятнее всего связаны с активнойинфекцией и ее прогрессированием [387].
По результатам других исследованийданный белок (ESAT6) рассматривался как рано секретируемый антиген на этапеформирования противотуберкулезного иммунитета, в экспериментах быладоказана его протективная роль [202; 381], и, как следствие, его можно было бырассматривать в качестве маркера ЛТИ [234], что противоречит исследованиям,указывающим на связь ESAT6 с ее прогрессированием [387]. Таким образом,данный антиген [202; 381; 387], с одной стороны, можно было рассматривать вкачестве маркера ЛТИ [234], с другой – активного специфического процесса[387].Порезультатамнашегоисследованиябылоустановлено,что189специфический белок ESAT6 необходимо рассматривать в качестве маркера ЛТИна этапе ее раннего развития при первичном инфицировании МБТ.
Так,положительныерезультатыиндуцированногоИФН-сЕSAT6чащерегистрировались среди детей с ЛТИ, чем среди больных ТБ (р=0,05). Сохранениеответа на ESAT6 на этапе развития ТБ свидетельствовало о благоприятномтечении заболевания, что характерно было для первичных форм у детей. Приэтом, определяя уровень индуцированного ИФН- с ESAT6, установили значимыепоказатели для оценки РППТИ, индекс стимуляции составил 4,2±0,8, для ТБпоказатель был незначим – и.с. 1,1±0,1 (U=4729; р=0,000). Таким образом,полученные результаты четко показали «место на спектре» туберкулезнойинфекции белка ЕSAT6, а именно на этапе ее раннего развития. Белок ESAT6является одним из двух основных компонентов нового диагностического теста (TSPOT.ТВ) [208], зарегистрированного на территории РФ и рекомендованного вкачестве альтернативного метода диагностики туберкулезной инфекции [124; 211;212].
При этом T-SPOT.ТВ (Oxford Immunotec, UK) не дифференцируетлатентную и активную туберкулезную инфекцию [208; 316; 330; 396; 468]. Второйбелок, входящий в состав T-SPOT.ТВ, – CFP10. Мы в своем исследовании данныйбелок рассматривали в виде гибрида с ESAT6 – ЕSAT6-CFP10. Полученныерезультаты позволили говорить об изменении свойств белка ESAT6 в связанном сCFP10 состоянии и рассматривать их для оценки активной туберкулезнойинфекции. Так, среди детей, больных ТБ, значимым был показатель уровняиндуцированного ИФН- с ЕSAT6-CFP10 – и.с. 7,3±0,8, для детей с ЛТИпоказатель был незначим, в том числе на этапе первичного инфицирования МБТ(РППТИ) – и.с.
1,2±0,4 (U=1291,5; р<0,0001).Еще один хорошо изученный специфический белок – 85a – в настоящеевремя рассматривается для возможности применения с диагностической целью.Ранее исследования показали, что антигенный комплекс 85 проявляет высокуюперекрестную реактивность с антигенами практически всех МБТ [387; 478], этоможет говорить о его низкой диагностической информативности для ЛТИ.Полученные результаты нашего исследования позволили говорить о Ag85a как о190белке, характеризующем латентную стадию туберкулезной инфекции, так какпоказатель индуцированного ИФН- с Ag85а был значим для РППТИ – и.с.3,0±0,6 (р=0,0002). При этом, несмотря на большую частоту регистрацииположительных результатов у детей с РППТИ (49,2%) (р=0,0005), выявленыположительные показатели и у детей с ПВА (17,6%), что, как мы и предполагали,снижало значимость белка для дифференциальной диагностики туберкулезнойинфекции у детей.Среди недавно идентифицированных белков был выбран один изперспективных антигенов МБТ – белок Rv2660c, который кодируется в областиRD11 МБТ [273].
Считается, что данный белок может относиться к латентнымантигенам [159; 355], хотя его функция в настоящее время до конца не определена[159]. Поэтому оценка возможности распознавания иммунными клетками белкаRv2660c на разных стадиях туберкулезной инфекции позволит расширитьпредставление о новом антигене. Результаты нашего исследования впервыепозволили говорить о белке Rv2660c как о маркере ранней стадии туберкулезнойинфекции при первичном инфицировании МБТ.
При определении индексастимуляции (и.с.) ИФН- после индукции Rv2660c у больных ТБ (1,6±0,3), у детейс ЛТИ (3,4±0,5) и у не инфицированных МБТ (1,0±0,2) были установленыразличия (Н=10,826; р=0,004). Сравнивая показатели ИФН- после индукцииRv2660c (и.с.) у детей, больных ТБ, в зависимости от генеза заболевания,установили достоверные отличия (U=724,5; р=0,031) в продукции цитокина приформировании первичных (и.с. 1,9±0,3) и вторичных форм (и.с. 0,8±0,2), чтоуказывало на протективную роль специфического белка. Наиболее высокийуровень цитокина после стимуляции Rv2660c установили на этапе РППТИ – и.с.5,1±0,8(U=4887;р=0,000).Такжеимеласьсильнаякорреляциямеждупоказателями индуцированного ИФН- с ЕSAT6 и Rv2660c (и.с.) (по Спирмену,r=0,77, р=0,000).
Таким образом, все это позволяет утверждать, что основное«место белка на спектре» туберкулезной инфекции находится на уровне раннейстадии ее развития и, следовательно, белок Rv2660c, так же как белок ЕSAT6,участвует в формировании адаптивного иммунитета. А, учитывая, что данные191белки не связаны с поствакцинальным иммунитетом, ЕSAT6 и Rv2660c можнорассматривать в качестве основных белков для диагностики РППТИ.Еще одним из недавно идентифицированных антигенов МБТ является белокCFP32B.
Установлено, что данный белок стимулирует гуморальный ответ [199;433], поэтому можно предположить его роль в прогрессировании ТБ. При этомпроводимые ранее исследования ограничены и противоречивы, что не позволяетоценить роль белка CFP32B на этапе развития туберкулезной инфекции, такженеобходимо учитывать, что ген данного белка обнаружен и в геноме БЦЖ [197;199; 222; 233; 274; 368; 407; 433]. По результатам наших исследованийустановлено, что для оценки активности инфекции и ее прогрессирования белокCFP32B мало значим. Дополнительно было установлено, что показатель значим удетей с РППТИ (и.с.
3,5±0,6; U=4459,5; р=0,000). При этом учитывая, что ответ наCFP32B сохранялся при вакцинации БЦЖ или БЦЖ-М, возможна перекрестнаяреакция с МБТ, все это снижает диагностическую значимость специфическогобелка. Таким образом, мы впервые идентифицировали белок CFP32B в качествепотенциального маркера для ЛТИ с невысокой диагностической значимостью.Комплексная оценка специфических белков позволила выделить нескольковариантов иммунного ответа: первый вариант был связан с выраженным ответомна ППД-Л и ЕSAT6-CFP10, а также слабовыраженным ответом на белки раннейстадии туберкулезной инфекции (ESAT6, Rv2660c, 85а, CFP32B); второй – сотсутствием ответа на стимуляцию антигенами; третий – с выраженным ответомна белки ранней стадии туберкулезной инфекции, слабовыраженным на ППД-Л иотсутствием ответа на гибридный белок.
Среди белков ранней стадиитуберкулезной инфекции по результатам ранжирования для ЛТИ былиустановлены значимые уровни для Rv2660c – R 3,984; ESAT6 – R 3,411, CFP32B –R 3,016 и 85а – R 2,958. Для ТБ значимым, кроме туберкулина, был гибридныйбелок, при ранжировании для них установлены наибольшие значения среднегоранга R 5,945 и R 4,573 (р<0,000001), при этом низкий уровень иммунного ответана специфические белки рассматривался в качестве риска неблагоприятноготечения заболевания (коэффициент риска 1,73 95% ДИ 1,059 – 2,828). Вариант192регистрации положительного ответа наЕSAT6-CFP10 у детей с ЛТИрассматривали в качестве риска развития ТБ (коэффициент риска составил 4,047;95% ДИ 2,797 – 5,856).Таким образом, мы установили, что белки ЕSAT6, Rv2660c, 85а и CFP32Bможно рассматривать в качестве маркеров ЛТИ на ее ранней стадии развития, агибридный белок ЕSAT6-CFP10, как показатель активной туберкулезнойинфекции, – преимущественно на стадии развития заболевания или высокогорискаТБ.АнтигеныППД-Л,85а,CFP32Bдлярешениявопросовдифференциальной диагностики ЛТИ и ПВА менее значимы, учитываяперекрестную реактивность между БЦЖ и МБТ.
В связи с этим мы определили вкачестве перспективных для оценки ЛТИ два антигена: ЕSAT6, Rv2660c, дляактивной – ЕSAT6-CFP10. Это позволило рекомендовать их для включения вспецифические иммунологические тесты по определению индуцированногоИФН- для диагностики и дифференциальной диагностики латентной и активнойтуберкулезной инфекции у детей.Мы предложили количественную оценку показателей индуцированногоИФН- для возможности использования данных при динамическом наблюдении.Впервые были определены значимые диагностические критерии по уровнюиндуцированного ИФН- специфическими антигенами (ППД-Л, ЕSAT6-CFP10,ЕSAT6, Rv2660c, 85а и CFP32B) для диагностики ТБ, ЛТИ и ПВА.
Для ПВА (длядетей раннего возраста) характерны показатели уровня ИФН- с ППД-Л до 4,0(и.с.), результат мог сочетаться с положительным (и.с. более 1,0) ответом настимуляцию CFP32B и/или 85а. Регистрация положительного (и.с. более 2,0)ответа на ЕSAT6 и/или Rv2660c исключала ПВА. Для диагностики ЛТИ былзначим уровень индуцированного ИФН- с ППД-Л 4,0 и более (и.с.), что моглосочетаться с положительными ответами на белки ранней стадии туберкулезнойинфекции (и/или: ЕSAT6, Rv2660c, 85а, CFP32B).
Для определения активнойтуберкулезной инфекции диагностическими являлись: уровень индуцированногоИФН- с ППД-Л более 19,0 (и.с.) и/или положительный (и.с. более 1,0) ответ наЕSAT6-CFP10.193Известно, что чувствительность теста на туберкулезную инфекцию сиспользованием одного антигена редко превышает 80% [158; 270]; привключении уже двух белков, как это установлено у T-SPOT.ТВ (OxfordImmunotec, UK), чувствительность составляет более 90% (92,0-94,1%) [330; 396].По этой причине выбор нескольких антигенов для возможности объективнойдиагностикитуберкулезнойинфекцииможетповыситьинформативностьспецифического теста. Оценивая информативность теста в нашем исследованиипо определению индуцированного ИФН- специфическими антигенами ППД-Л,ЕSAT6-CFP10, ЕSAT6, Rv2660c, 85а и CFP32B мы установили его высокуючувствительность на уровне 98,33% (95% ДИ 91,14-99,71%) и специфичность –100% (95% ДИ 85,13-100%).Знанияобиомаркерахимеютбольшоезначениевдиагностикетуберкулезной инфекции, поэтому их оценка являлась приоритетом в нашемисследовании.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
