Диссертация (1139649), страница 14
Текст из файла (страница 14)
tuberculosis, M. bovis или M. bovis BCG, четвертая –внутренним контрольным образцом (ВКО). В составе реакционной смеси73присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которыегибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, врезультатечегопроисходитнарастаниеинтенсивностифлуоресценции.Гибридизационно-флуоресцентная детекция сигналов продуктов амплификацииосуществляется непосредственно в процессе ПЦР с помощью амплификатора врежиме «реального времени».Работапроводиласьвлаборатории(МГНПЦбТ),выполняющеймолекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала, наналичие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарноэпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмамиIII–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»,СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращениюсмедицинскимиотходами»иметодическихуказанийМУ1.3.2569-09«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификациинуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IVгрупп патогенности».
В табл. 2.3 представлена аналитическая чувствительностьметодов.74Таблица 2.3Аналитическая чувствительностьАналитическая чувствительность, м.т./млВидклиническогоматериалаPBS-буферМочаМокрота1,БАЛ/ПВБPBS-буферМокрота3,БАЛ/ПВБМоча10 % гомогенатразных видовтканейКомплектдлявыделенияДНК«РИБОпреп»«ДНК-сорбВ»«ДНК-сорбС»АмплиСенс®«АмплиСенс®МТСМТС-FL»diffFL»M.tuberculosis(штамм H37 Ra)5х1021х1031х1035х103«АмплиСенс®МТС-FL»АмплиСенс®МТС-diff-FL»M.bovis BCG(штамм M.bovis BCG)1х1031х1031х1031х1035х1021х1031х1031х1035х1021х1031х1031х1035х1025х1031х1035х1031х1035х1031х1035х1031х1021х1035х1021х103Или аналогичному по названию каналу детекции в зависимости от используемого прибора.Концентрация в 1 мл мокроты, обработанной реагентом для предобработки слизистогоматериала «МУКОЛИЗИН».3Или аналогичный в зависимости от прибора: Green/FAM/FAM-490, Yellow/JOE/JOE-530/HEX,Orange/ROX/ROX-575, Red/Cy5/Cy5-635.12В таблице 2.4 представлена программа амплификации «95-65-72 MTC» дляприборов Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q(Qiagen, Германия), iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), «ДТ-96» («ДНК-Технология»,Россия).75Таблица 2.4Программа амплификации «95-65-72 MTC» для приборов Rotor-Gene 3000/6000(Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия), iCycler iQ5 (BioRad, США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия)ЦиклТемпература, °СВремяИзмерениефлуоресценции9515 мин–9565729515 с30 с15 с15 с6530 с7215 с––––FAM, JOE, ROX,Cy52–УдержаниетемпературыЦиклированиеЦиклирование 2Кол-воциклов1540Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала почетырем каналам – анализировались и интерпретировались после окончанияработы амплификатора с помощью программного обеспечения прибора,используя установки, указанные во вкладыше, прилагаемом к ПЦР-комплекту, иметодическихрекомендацийпоприменениюнаборареагентовдлядифференцирования микобактерий туберкулеза (M.tuberculosis, M.bovis и M.bovisBCG) в клиническом материале и культурах микроорганизмов методомполимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентнойдетекцией«АмплиСенс®MTC-diff-FL»,разработанныхФБУНЦНИИЭпидемиологии Роспотребнадзора.Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия)пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствуетналичию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct (Сp) в соответствующейграфе в таблице результатов.
Граничные значения Ct для конкретного приборауказаны во вкладыше, прилагаемом к «ПЦР-комплекту».Результат амплификации по каналу считается положительным (+), если криваяфлуоресценции имеет типичную для ПЦР в режиме «реального времени» Sобразную форму, однократно пересекается с пороговой линией на участке76характерного экспоненциального подъема флуоресценции, и значение пороговогоциклаCt(Сp)дляданногоканаламенееилиравноуказанному;сомнительным (> Сt) – в случае, если значение порогового цикла большеуказанного; отрицательным (–) – в случае отсутствия кривой типичной формы, непересекающейся с пороговой линией (нет значения Ct (Cp).Невалидныйрезультатпоканалуформируетсяизсовокупностиотрицательного значения по этому каналу, и отрицательного или сомнительногорезультата по каналу Cy5, который воспроизвелся при повторном анализе пробы.Положительный результат по каналу FAM2 свидетельствует о наличии вобразце ДНК микобактерий туберкулеза человеческого вида (M.tuberculosis), поканалу JOE5, – ДНК микобактерий туберкулеза бычьего вида (M.bovis и M.bovisBCG), по каналу ROX5– ДНК вакцинного штамма микобактерий туберкулезабычьего вида (M.bovis BCG), по каналу Cy55 – об адекватном прохождении этаповэкстракции и амплификации ВКО.ИнтерпретациярезультатовдифференцированиявидовM.tuberculosiscomplex осуществлялась независимо по каждому из каналов.
Набор реагентовпозволяет выявлять указанные виды M.tuberculosis complex в смесях (например,смесь M.tuberculosis и M.bovis или M.tuberculosis и M.bovis BCG). Исключениесоставляет смесь M.bovis и M.bovis BCG, что связано с принадлежностьювакцинного штамма M.bovis BCG к бычьему виду.Нами обследованы 86 детей, направленных с целью диагностики идифференциальной диагностики туберкулеза и осложнений вакцинации БЦЖ.Все дети были разделены на 3 группы: 1 группа – больные активнымтуберкулезом (n=29), 2 группа – с осложнениями вакцинации БЦЖ (n=22), 3группа – инфицированные МБТ (контрольная группа) (n=35), в процессеобследования которой туберкулез любой активности был исключен.772.4. Методы статистического анализаСтатистическая обработка материала проведена с помощью методоввариационной статистики на основе анализа абсолютных и относительныхвеличин. Применяли стандартные методы:– рассчитывали интенсивные и экстенсивные показатели (с 90% и 95%интервалами неопределённости), средние величины, стандартное отклонение.Если распределение количественных показателей отличалось от нормальногораспределения, либо число измерений было небольшим, применяли квартильныйанализ: вычисляли медиану, 25% и 75% квартили, межквартильные интервалы;– рассчитывали статистическую значимость различий (p), значение p< 0,05считалось статистически значимым уровнем достоверности отличий;– рассчитывали отношение шансов, относительный риск;–рассчитывалидиагностическуюэффективность,чувствительность,специфичность применения лабораторных методов исследования;–дляопределениястатистическойзначимостиразличиймеждунесвязанными выборками использовали U-критерий Манна-Уитни.СтатистическиеиспользованиемрасчётыEpiInfo,ипостроениелицензионнойграфиковпрограммыпроводилиStatisticaверсиис10,стандартных функций электронных таблиц MS Excel, входящего в пакет MSOffice XP.78ГЛАВА 3.МОНИТОРИНГ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ПОСЛЕВАКЦИНАЦИИ БЦЖ/БЦЖ-М НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙФЕДЕРАЦИИ3.1.
Мониторинг осложнений БЦЖ/БЦЖ-М на территории РФДляосуществлениянаучно-исследовательской,организационнометодической и лечебной работы в области проведения мониторинга заосложнениями после туберкулезной вакцины БЦЖ/БЦЖ-М в 1995 г. был созданРеспубликанский Центрпоосложнениям противотуберкулезнойвакциныМинздрава России при НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова. Анализ каждого ОПИБ, сведения, о которых были присланы изсубъектаРоссийскойФедерации,проводитсяспециалистами-фтизиатрамиЦентра.Мониторинг ОПИБ, проводимый с целью выработки управленческихрешений, должен решать следующие задачи:– определение роли проблемы ОПИБ для определения значимостивакцинации БЦЖ/БЦЖ-М и периодической оценки оправданности проведениямассовой иммунизации данной вакциной (по соотношению потенциальногоположительного её воздействия и риска возникновения осложнений).
С этойцельюнеобходимосистематическиполучатьинформациюоколичествезарегистрированных ОПИБ и рассчитывать частоту их возникновения средивакцинированных детей;– оперативное реагирование на появление реактогенных серий вакцины иих изъятие из употребления;– выявление дефектов проведения вакцинаций по критерию выполненияусловий хранения и применения вакцины БЦЖ;79– проведение прикладных научных исследований с целью уточненияпоказаний и противопоказаний к вакцинации БЦЖ;– определение адекватности и результативности оказания медицинскойпомощи детям с ОПИБ.В настоящее время информация об ОПИБ получается из следующихисточников:– форма ФСН № 33 «Сведения о больных туберкулёзом (далее – ф.
№ 33);– информация из Регистра ОПИБ, в которую вносятся сведения из картырегистрации больного после иммунизации туберкулёзной вакциной [94].Сведения ф. № 33 позволяют получить информацию о детях с ОПИБ,взятых на диспансерный учёт по данному заболеванию в течение отчётного года.В данную форму потенциально могут не включаться случаи ОПИБ, выбывшие изрегиона до постановки на диспансерный учёт, либо не взятые на диспансерныйучёт по иным причинам, ожидаемое количество которых невелико. Однако даннаяинформация может содействовать решению только первой (эпидемиологической)задачи мониторинга, и не может содействовать решению остальных задачмониторинга.Информация из Регистра ОПИБ потенциально может решать большинствозадач мониторинга осложнений после иммунизации вакциной БЦЖ.
Однако,поскольку информация для внесения в этот регистр получается с использованиемпочтовых отправлений, имелись сомнения в полноте и оперативности полученияинформации. Чтобы проверить гипотезу о полноте и оперативности внесенияинформации мы провели анализ сведений Регистра ОПИБ путём сопоставлениясведений из него со сведениями ф. № 33, а также сопоставления сведений осроках постановки диагноза ОПИБ с датой внесения информации в Регистр.80Таблица 3.1Сопоставление сведений о числе детей, взятых на диспансерный учёт поповоду ОПИБ в ф.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
