Диссертация (1139576), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Наличие впародонтальныхкарманахмолекулярныхмаркеровбактерийпародонтопатогенной группы P. gingivalis (R = 0,297) и T. forsythia (R = 0,268)статистически достоверноумеренно коррелировало с содержаниемα-дефензинов в плазме периферической крови. Слабая корреляция отмечена для T.denticola (R = 0,203) и количества видов пародонтопатогенов в ассоциациях (R =0,236), а также с наличием сопутствующей патологии ЖКТ (R = 0,268).Таким образом, увеличение уровня α-дефензинов (в десневой жидкости ив плазме периферической крови) может быть связано с возрастом и поломпациента, состоянием гигиены полости рта, наличием кариозных поверхностейи пародонтопатогенных видов бактерий P.
gingivalis, T. denticola, T. forsythia,сопутствующих заболеваний и других признаков.5.4.Экспрессия на лейкоцитах десневой жидкости рецепторовврожденного иммунитета TLR-2 и TLR-4Хронический пародонтит начинается с последовательной колонизацииширокого круга бактерий и сохраняется при участии иммунных воспалительныхреакций, влияющих на биопленку. Распознавание микробов в значительной218степени опосредуется Toll-подобными рецепторами, которые взаимодействуютс консервативными патоген-ассоциированными молекулярными паттернами.Распознавая специфические лиганды, TLR-2 и TLR-4 взаимодействуют сбольшинством пародонтопатогенов [52, 59, 442].Задачей данного фрагмента нашей работы явилась оценка экспрессии Tollподобных рецепторов на лейкоцитах десневой жидкости.
В этой частиисследования участвовали по 20 человек из каждой группы.В качестве исследуемого материала мы использовали смывы десневойжидкости из ПК или зубодесневой борозды раствором Хэнкса. Клетки из осадкаокрашивали антителами к CD282 (TLR-2) или СD284 (TLR-4), меченными FITC,затем фиксировали параформальдегидом. Микроскопическое исследованиепроводили с помощью микроскопа ECLIPSE 50i (Nicon, Япония), увеличение×1000.Частота выявления клеток, несущих CD282 (TL-2) и СD284 (TLR-4), упациентов контрольной группы составила 10,3 ± 3,2% и 13,6 ± 3,4%, в группепациентов с ХП в фазе обострения статистически достоверно в 3 раза ниже —4,1 ± 2,1% и 5,7 ± 2,3% (p < 0,05), у больных ХГ — 15,1 ± 1,9% и 8,6 ± 2,3% и упациентов с КАП 5,3 ± 2,1% и 4,6 ± 1,9%.На рис.
64 представлены клетки из десневой жидкости, экспрессирующиеCD282 (TLR-2), меченные FITC. В клетках видны бледно и ярко окрашенныегранулы. При фазовом контрасте можно было наблюдать лейкоциты,выделенные из смыва ПК (рис. 65).219Рис. 64. Иммунофлюоресцентная микроскопия лейкоцитов из смыва ПКэкспрессирующих CD282 (FITC). Увеличение ×1000 разРис. 65. Лейкоциты из смыва ПК в фазовом контрасте.Увеличение ×1000 разНа рис. 66 показаны те же лейкоциты с неярким диффузным окрашиваниемCD284 (иммунофлюоресцентная микроскопия, FITC).На рис.
67 представлены клетки с более интенсивной экспрессией CD284— FITC (TLR-4).220Рис. 66. Иммунофлюоресцентная микроскопия лейкоцитов из смыва ПКэкспрессирующих CD284 (FITC). Увеличение ×1000 раз.Рис. 67. Иммунофлюоресцентная микроскопия лейкоцитов смыва ПКэкспрессирующих CD284 (FITC). Увеличение ×1000 разИз смывов в области зубодесневой борозды или ПК мы выделяли по 5–10× 103 клеток в мл — примерно на 2 порядка меньше, чем обычно требуется дляиммунофенотипирования в проточном цитометре (3,5–9,4 × 106 клеток в мл).Поэтому в последующем мы определяли наличие маркеров TLR-2 и TLR-4 налейкоцитах венозной крови обследованных пациентов согласно стандартнымметодикам.221Примеры детекции рецепторов CD14 и CD282; CD3 и СD284 на клеткахвенозной крови — нейтрофилах, лимфоцитах и моноцитах демонстрируютследующие фотографии (рис.
68 и 69). Экспрессию TLR-2 отмечали намоноцитах (при двойном окрашивании CD14 и CD282), а TLR-4 — налимфоцитах (при двойном окрашивании CD3 и CD284), однако она была оченьнизкой и не превышала 1%.При выделении лейкомассы из периферической крови с 2%-ной желатинаобычно происходит потеря клеток каких-либо субпопуляций.
Поэтому наследующемэтапемыпровелиокрашиваниеклетоквенознойкровиодновременно с использованием нескольких АТ к разным популяциямлейкоцитов, которые метили разными флюоресцеинами (метками).А. CD282F/CD14PEБ.ВГ.Рис. 68. Изучение экспрессии TLR-2 на лейкоцитах венозной кровиПримечание:А. — график распределения клеток при переднем и боковом светорассеянии: зеленый цвет— нейтрофилы; красный цвет — лимфоциты; синий цвет — моноциты.Б, В, Г — демонстрация экспрессии СD14, CD282 и CD14+, CD282 соответственно (клеткиразных популяций лейкоцитов) на двумерном точечном графике (dot-plot),222А.
CD284F/CD3PEБ.В.Г.Рис. 69. Изучение экспрессии TLR-4 на лейкоцитах венозной кровиПримечание:А. — график распределения клеток при переднем и боковом светорассеянии: зеленый цвет— нейтрофилы; красный цвет — лимфоциты; синий цвет — моноциты.Б, В, Г — демонстрация экспрессии СD3, CD282 и CD3+CD282 соответственно (клеткиразных популяций лейкоцитов) на двумерном точечном графике (dot-plot)Тем не менее относительное число клеток, экспрессирующих молекулуCD282 (TLR-2), оказалось незначительным. Так, самый высокий уровеньэкспрессии маркеров CD282 (TLR-2) был на лимфоцитах людей контрольнойгруппы 1,06 ± 0,45% (0,51–1,51%), в абсолютных значениях 24,38 ± 10,35 (14,03–34,73) млн.
кл./литр (таблица 33).Относительное (0,35 ± 0,01%), и абсолютное (7,53 ± 0,22 млн. кл./л) числолимфоцитов, которые экспрессировали CD282, у пациентов группы 1а оказалосьдостоверно ниже (в 3 раза), чем в контрольной группе. У пациентов группы 1ботносительное число лимфоцитов (0,31 ± 0,05%), которые экспрессировалиCD282, также было в 3 раза ниже, чем в контрольной группе, а абсолютное — в3,9 раза (6,18 ± 1,01 млн кл./л). Процентное содержание лимфоцитов, несущих223рецепторы этого типа, у представителей 1в группы (0,26 ± 0,05%) было в 4 раза,а абсолютное (5,56 ± 0,21 млн кл./л) — в 5,3 раза меньше, чем на лимфоцитахлюдей со здоровым пародонтом.
У больных КАП процентное содержаниеCD282+-лимфоцитов (0,31 ± 0,03%) было ниже в 3,4 раза, а абсолютное (7,53 ±0,73 млн кл./л) — в 3,2 раза при р < 0,05. Тем не менее у больных ХГ процентноесодержание CD282+--лимфоцитов (1,46 ± 0,25%) было статистически достовернов 1,4 раза, а абсолютное количество (32,56 ± 5,58 млн кл./л) — в 1,3 раза больше(р > 0,05), чем в контрольной группе.Таблица 33Оценка экспрессии молекул CD 282 (TLR 2) на лейкоцитах венозной кровив группах сравнения (М ± Δ)ГруппыЕд.Экспрессия маркера CD 282 (TLR 2)сравнения измерения НейтрофилыМоноцитыЛимфоцитыконтрольная%0,34 ± 0,040,65 ± 0,111,06 ± 0,45абс., млн/л 18,31 ± 2,322,16 ± 0,3724,38 ± 10,351а%0,22 ± 0,01*0,91 ± 0,430,35 ± 0,01*абс., млн/л 6,13 ± 0,93*2,71 ± 1,287,53 ± 0,22*1б%0,12 ± 0,01*0,57 ± 0,280,31 ± 0,05*абс., млн/л 3,17 ± 1,03*1,61 ± 0,796,18 ± 1,01*1в%0,08 ± 0,01*0,27 ± 0,13*0,26 ± 0,05*абс., млн/л 2,87 ± 2,03*0,89 ± 0,40*5,56 ± 0,21*2%0,44 ± 0,05*0,85 ± 0,09*1,46 ± 0,25абс., млн/л 23,14 ± 2,26*3,14 ± 0,29*32,56 ± 5,583%0,10 ± 0,01*0,51 ± 0,230,31 ± 0,03*абс., млн/л 2,98 ± 0,93*2,09 ± 0,94*7,53 ± 0,73*Примечание:* — различия статистически достоверны по сравнению с контрольной группой(при р < 0,05).Количество CD282+-моноцитов в венозной крови у респондентов группы1а с ХПЛ (0,91 ± 0,43% или 2,71 ± 1,28 млн/л) было в 1,3 раза выше, чем вконтрольной группе (0,65 ± 0,11% или 2,16 ± 0,37 млн/л), однако эти различияоказались статистически недостоверными.
У респондентов группы 1б с ХПС224абсолютное (1,61 ± 0,79 млн кл./л) и относительное (0,57 ± 0,28%) количествомоноцитов, экспрессирующих TLR-2, было также статистически недостоверно в1,3 раза меньше, чем у индивидуумов в контрольной группе. В группе больных1в с ХПТ процентное (0,27 ± 0,13%) и абсолютное (0,89 ± 0,40 млн кл./л)содержание CD282+-моноцитов было в 2,4 раза меньше, чем в контроле.
Приэтом содержание CD282+-моноцитов у больных с ХПС было статистическидостоверно ниже в 1,7 раз, а у больных с ХПТ — в 3,0 (процентное) и 3,4 раза(абсолютное) меньше, чем у пациентов с ХПЛ.У больных КАП абсолютное содержание моноцитов, экспрессирующихэти рецепторы (0,51 ± 0,23%, 2,09 ± 0,94 млн/л), практически не отличалось отсодержания у здоровых людей.
При ХГ содержание в периферической кровиданной субпопуляции моноцитов было в 1,3 (процентное) и 1,5 (абсолютное)раза выше, чем в контрольной группе (р < 0,05).Количество нейтрофилов, которые экспрессировали CD282, оказалосьсущественно ниже. Так, у пациентов с интактным пародонтом (контрольнаягруппа) эти маркеры выявлены на 0,34 ± 0,04% (18,15 ± 2,16 млн/л) нейтрофилов.У пациентов группы 1а — в 1,5 раза реже (0,22 ± 0,01%, 6,13 ± 0,93 млн/л); упациентов группы 1б — в 3–5 раз (0,12 ± 0,01% и 3,17 ± 1,03 млн/л) меньше, и упациентов группы 1в — в 4,3–6,3 раза (0,08 ± 0,01% и 2,87 ± 2,03 млн/л) реже, посравнению с контрольной группой. При КАП процентное содержание (0,10 ±0,01%) CD282+-нейтрофилов было в 3,4 раза, а абсолютное (4,36 ± 0,44 млн/л) —в 4 раза меньше, чем в норме. У больных ХГ содержание CD282+-нейтрофилов(0,54 ± 0,05%, 27,43 ± 2,54 млн/л) было статистически достоверно выше в 1,6раза, чем у здоровых людей.Частота распределения лейкоцитов периферической крови, которыеэкспрессировали CD284 (TLR-4), была аналогична описанной выше для СD282(TLR-2), однако в группе 1а лимфоцитов с этим типом рецепторов быловыявлено статистически достоверно значимо больше в 2,8 раза (0,73 ± 0,13%) и2,6 раза (15,69 ± 2,79 млн/л), чем у людей в контрольной группе (0,26 ± 0,12%,5,98 ± 2,76 млн/л).
В группе 1б относительное и абсолютное содержание CD284+-225лимфоцитов было выше (0,56 ± 0,14% и 11,31 ± 2,83 млн/л), чем у людей синтактным пародонтом в 1,9 раза. Доля CD284+-лимфоцитов у больных 1вгруппы (0,31 ± 0,11%) и их абсолютное количество (6,63 ± 4,19 млн/л) были в 1,2раза больше, чем в контроле (р > 0,05). При этом у этих больных содержаниеCD284+-лимфоцитов было статистически достоверно меньше, чем у больных ХПлегкой и средней степени тяжести. У больных КАП содержание CD284+лимфоцитов (0,39 ± 0,12%, 9,48 ± 0,86 млн/л) было статистически достоверновыше контрольных значений в 1,6 раза. Более чем в 3 раза было CD 284+лимфоцитов (0,85 ± 0,14%, 18,96 ± 3,12 млн/л) у пациентов с ХГ, по сравнениюсо здоровыми людьми и больными ХПТ и в 1,5 раза больше, чем у больных ХПС(р < 0,05).Наибольшее количество CD 284+-моноцитов было выявлено у больных ХГ:2,35 ± 0,25%, 7,52 ± 0,80 млн/л, в 16 раз больше как в долевом значении, так и вабсолютных (0,47 ± 0,13 млн/л) величинах по сравнению со здоровыми людьми.У пациентов с ХПЛ содержание этой субпопуляции (2,17 ± 0,18%, 6,47 ± 0,54млн/л) было выше в 14 раз, чем у пациентов контрольной группы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
