Диссертация (1139576), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Висследуемом материале из биопленки ДНК T. forsythia, A. actinomycetemcomitans,P. gingivalis, T. denticola, P. micra, F. nucleatum, E. nodatum, E. corrodents иCapnocytophaga spp. выявляли статистически достоверно чаще, чем в десневойжидкости на 11–23%. При этом частота выявления пародонтопатогенных видовбактерий 1 порядка увеличивалась в зависимости от степени тяжестипародонтита от 4 до 12 раз, а P. gingivalis — от 37 до 75 раз по сравнению создоровыми людьми.
Частота выявления пародонтопатогенных видов бактерий 2порядка увеличивалась от 2 до 12 раз. Разница в частоте выявления P. intermediaи C. rectus была статистически недостоверной.При кандида-ассоциированном пародонтите ДНК пародонтопатогенов244также выявляли чаще в биопленке по сравнению с десневой жидкостью, норазница была статистически недостоверной, за исключением частоты выявленияT. forsythia, A. actinomycetemcomitans и F. nucleatum. ДНК пародонтопатогенов 1порядка не была идентифицирована у 33% больных КАП в десневой жидкости иу 13% — в биопленке, но была выявлена ДНК С.albicans.При КАП один вид пародонтопатогенов 1 порядка был определен у 43%человек в десневой жидкости и статистически достоверно реже — у 25% вбиопленке; два вида — у 38% больных в десневой жидкости, у 35% пациентов— в биопленке.
Три или четыре вида в ассоциации определили в биопленке, ноне в десневой жидкости у 18% пациентов. Пять видов пародонтопатогенов вассоциации у больных КАП не выявляли. Следовательно, у больных КАП ДНКпародонтопатогенов 1 и 2 порядков определяли реже как в десневой жидкости,так и содержимом биопленки, чем у больных ХП.Недавно было установлено, что вирулентность C. albicans повышается взрелыхсмешанныхмноговидовыхбиопленках,культивируемыхнареконструированных эпителиальных клетках человека (RHOE) по сравнению содновидовыми биопленками. При этом наблюдается повышение секреции IL-18,активности ЛДГ и инвазивности C. albicans. В ответ на инфицирование C.albicans эпителиальные клетки полости рта продуцируют большие количестваIL-6, IL-8 и TNF- α, что указывает на то, что цитокины играют значительнуюроль в контролировании инфекций полости рта [129, 350]. После контакта с C.parapsilosis гингивальные эпителиальные клетки человека экспрессируютвысокие уровни mRNA TLR2, TLR4, но не TLR9.
Повышенным уровнемцитокинов и АМП можно объяснить увеличением уровней цитокинов и АМПможно объяснить ингибирование роста C. parapsilosis на эпителиальных клеткахдесен [130, 163].В настоящее время стало очевидным, что биопленки полости ртазапускают хронические воспалительные реакции, которые обусловливаютдеструктивные процессы при пародонтите.
Однако характерные особенностиспецифических клеток отвечать на биопленки плохо изучены. R. Peyyala с соавт.245(2012) [385] разработали модели биопленок со Streptococcus sanguinis,Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Actinomyces naeslundii, Fusobacteriumnucleatum и Porphyromonas gingivalis на твердых газопроницаемых контактныхлинзах. Биопленки и планктонные культуры инкубировали при анаэробныхусловиях с линией OKF4 эпителиальных клеток в течение 24 часов.
БиопленкиP. gingivalis значительно ингибировали продукцию Gro-1α, IL1α, IL-6, IL-8,TGFα, фракталкина (CX3CL1), MIP-1α и IP-10. В целом биопленки всех видовбактерий ингибировали продукцию Gro-1α, TGFα и фракталкина, тогда какбиопленки F. nucleatum стимулировали значительное увеличение продукции IL1α, IL-6, IL-8 и IP-10.
Биопленки A. naeslundii индуцировали повышенные уровниIL-6, IL-8 и IP-10. Планктонные стрептококки полости рта и в виде биопленкислабо стимулировали выделение любого из этих медиаторов эпителиальнымиклетками.Результаты данных исследований показали, что биопленки и планктонныебактерии полости рта индуцировали различные ответы. Более того, некоторыевиды бактерий в биопленках обладали высокой стимулирующей активностью ипри взаимодействии с рецепторами клеток организма индуцировали ответ,отличный от отдельных бактерий.Известно, что образование биопленок оказывает значительный вклад вформирование у бактерий резистентности к антибиотикам и факторамврожденного иммунитета организма хозяина [135, 254, 280, 305].
Даженесмотря на то, что в области изучения биопленок получены важные научныерезультаты, контроль биопленок остается всё еще не решенной проблемой иявляется центральным направлением современных исследований.В настоящее время исследования направлены на открытие нетрадиционныхисточников противомикробных препаратов, секвенирование микробных геновфокусируется на определение экспрессии генов резистентности к антибиотикам,метагеномов и поиска новых мишеней патогенных бактерий.
В этой связивыделяются естественные вещества, называемые антимикробными пептидами(AMP), так как они имеют более высокую скорость поражающего действия и246мощностьзащиты,чемкомбинированныенаборытрадиционныхпротивомикробных препаратов. Более того, природные вещества обычно болеекомплексны, чем синтетические, и являются рабочими платформами сжизнеспособными и биологически подтвержденными исходными точками длядизайна химических библиотек [286, 433].Мы предложили собственные оригинальные модели для формированиябиопленок пародонтопатогенных бактерий, в частности многослойную модельсмешанной биопленки — S. sanguinis+F. nucleatum+P.gingivalis, основанную насочетании ранних, промежуточных и поздних колонизаторов пародонта (ЗаявканаизобретениеРФ«Способформированиясмешаннойбиопленкипародонтопатогенных анаэробных бактерий в условиях текучих сред in vitro» №2015149913 / 20(076763)).
В основу данной модели, в отличие от аналогов,положен главный принцип — формирование биопленки в условиях текучейсреды и анаэробиоза. Для оценки чувствительности к антибактериальнымпрепаратамнепосредственнобиопленкообразующихприштаммов)культивированиинамипредложенабиопленки(длямодифицированнаябиофильмограмма в триацетатных планшетах на двухфазной питательной среде,также с обеспечением движения жидкой фазы в условиях анаэробиоза (Заявкана изобретение РФ «Способ определения чувствительности облигатноанаэробных микроорганизмов в биопленке к антимикробным средствам» №2016111845).Мы установили, что наиболее часто применяемые (за последние 20-30 лет)в стоматологической практике препараты – метронидазол и линкомицинпродемонстрировали самое высокое число устойчивых штаммов – 52,3 % и 22,7% соответственно, причём чувствительных к метронидазолу штаммов было в 3,9раза меньше, чем устойчивых, а для линкомицина это соотношениеприближалось к 1:1.Количество метициллин-резистентных штаммов составило 11,4 %, чтокоррелировало с выявлением генов резистентности CTX-M-2 у 16,7 % штаммов.Прииспользованииβ-лактамаза-защищённыхпрепаратов(амоксиклав)247показатель резистентных штаммов снижался до 2,3 %, что коррелировало свыявление гена резистентности Mec-1 у 5,5 % штаммов.
Резистентность ккарбопенемам (имепенем) выявлена только у 2,3 % штаммов, что коррелировалос выявлением гена VIM у 2,8 %.Резистентность к макролидам (спирамицин) выявлена у 13,6 % штаммов,что коррелировало с наличием гена Erm выявлен у 11,1 % штаммов.Резистентность к тетрациклинам (доксициклин) выявлена только у 4,6 %штаммов, а ген Tet - у 11,1 % штаммов, корреляционная зависимость невыявлена.Резистентность к гликопептидам (ванкомицин) выявлена у 13,6 % штаммов,а гены VanA и VanB выявлены у 3,3 % штаммов, корреляционная зависимостьтакже не подтверждена.Резистентность к фторхинолонам разных поколений – ципрофлоксацину имоксифлоксацину выявлена у 13,6 % и 4,6 % штаммов соответственно, аплазмиды QnrB – у 5,5 % штаммов, при этом установлена прямая высокаякорреляционная зависимость для моксифлоксацина.Таким образом, для большинства изученных антибактериальных препаратов(β-лактамы,карбапенемы,макролиды,фторхинолоны)установленадостоверная взаимосвязь между наличием генов, кодирующих резистентность, ирезультатами фенотипического метода определения чувствительности.
Случаиеё отсутствия (тетрациклины, гликопептиды) могут быть обяъснены наличиемдополнительныхгенетическихмаркероврезистентности,которыенеучитывались в нашем исследовании, так как помимо генов Tet, VanA и VanBотвечающих за устойчивость к данным антибиотикам, возможно её кодированиедругими хромосомными генами и плазмидами.В связи с проблемой роста антибиотикорезистентности в последние годы вкомплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта много вниманияуделяется применению эубиотических препаратов, укрепляющих барьерыколонизационной резистентности организма человека за счет микробногоантагонизма [14, 19, 26, 45, 75, 76, 78].
В отечественной и зарубежной литературе248описаны попытки применения лактококков и лактобактерий для леченияпародонтита и профилактики рецидивов [104, 441].Вместе с тем к стабилизирующей микрофлоре полости рта относятся такжевейлонеллы (Veillonella parvula) и слюнные стрептококки (Streptococcussalivarius). Последние, как известно, являются ведущим антагонистомкариесогенных стрептококков и основных пародонтопатогенных видов [70, 157,281, 359, 410], однако их эффективность при воспалительных заболеваниях впародонте не изучена, что и послужило основанием для проведения намиэкспериментальногоисследования,котороепоказалоэффективностьколонизации биопленки пародонта у крыс кандидатными пробиотическимиштаммами стабилизирующей микрофлоры полости рта Veillonella parvula иStreptococcus salivarius (V+S).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
