Диссертация (1139571), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Процедуру выделения микробныхбелков завершали нанесением их (по 0,001 мл) на мишень для MALDI-TOF-массспектрометрии. В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричнуюкислоту. Для повышения достоверности каждый образец тестировали втриплетах.
Снятие спектров проводили в ручном режиме, диапазон спектра — 2–20 кДa. Для каждого образца получали не менее 1000 спектров. Статистическуюобработку масс-спектров проводили с помощью программы Biotyper 3.0 RTC.Степень достоверности идентификации оценивали по полученным значениям58Score, сравнивая с данными спектров референсной библиотеки Biotyper 3.0.Случаи со Score <1,7 рассматривали как недостоверные и не учитывали в качествеслучаев успешного определения таксономической принадлежности изолята [263].Посевы биологического материала производили на питательные среды:кровяной агар и Uri-select агар (BioRad, США), затем инкубировали в термостатепри температуре 37°С в течение 24 - 48 ч.
Видовую идентификацию проводили намасс-спектрометреMALDI-TOF-MS(BrukerDaltonics,Германия)ивбаканализаторе Vitek 2.2.1.1. Определение чувствительности к антибиотикамДля определения чувствительности к антимикробным препаратам (АМП)использовали три метода: диско-диффузионный (диски Bio-Rad, США), метод Етестов (BioMerieux, Франция) на среде Мюллера-Хинтона (Biorad, США) иавтоматизированный метод на баканализаторе VITEK 2 Compact (BioMerieux,Франция). Метод Е-тестов использовали для определения МПК имипенема,меропенема и тигециклина. Результаты интерпретировали, руководствуясьоценочными критериями (breakpoint) EUCAST [170] и клинические рекомендации[33] (Таблица 2.1).Таблица 2.1Критерии оценки чувствительности к антибиотикам EUCAST 2015SAM1,2AcinetobactersppSR≤>8/416/84COX2н/тАнтибиотик24МПК (мг/л) EUCASTEnterobacteriaceaesppSR≤>н/тн/тP.
aeruginosaS≤н/тR>н/тн/т12н/тн/т4FEP8161488CZD2н/тн/т1488SXT224н/тн/тн/тн/т59Продолжение таблицы 2.1AcinetobactersppSR≤>28АнтибиотикIMP2MEM22CIP2AKN2GMN2NTM2TMNP. aeruginosaS≤4R>8282828110,510,5181681681644244444244444н/тн/т442н/тн/т12н/тн/т2н/тн/т3232н/тн/тTGCFOSМПК (мг/л) EUCASTEnterobacteriaceaesppSR≤>28Примечание:1Пограничные значения, рекомендуемые CLSI2SAM - Ампициллин/Сульбактам, COX – Цефотаксим, FEP –Цефепим, CZD - ЦефтазидимSXT - Ко-тримоксазол, IMP – Имипенем, MEM – Меропенем, CIP – Ципрофлоксацин, AKN –Амикацин, GMN – Гентамицин, NTM – Нетилмицин, TMN - Тобрамицин, TGC –Тигециклин, FOS – Фосфомицинн/т – не тестировалиЧувствительностькантибиотикамдиско-диффузионнымметодомопределяли, используя диски с меропенемом, имипенемом, эртапенемом,амикацином,гентамицином,нетилмицином,цефтазидимом,цефепимом,ципрофлоксацином (БиоРад, Франция).
В качестве контрольных штаммовиспользовали E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, P. aeruginosa ATCC 27653,A. baumannii ATCC 19606.Дляописаниярезультатовтестированияантибиотикорезистентностииспользовали терминологию «нечувствительные» и «чувствительные» бактерии.Нечувствительными считали штаммы слабочувствительных и резистентныхкатегорий; остальные штаммы относили к чувствительным.
В отношенииустойчивостиккарбапенемамштаммыделилина2группы:карбапенемчувствительные (карба-Ч) и карбапенемрезистентные (карба-Р). Кгруппе карба-Ч относили изоляты, имеющие значения МПК меропенема и60имипенема в диапазоне чувствительных. К карба-Р относили штаммы срезистентностью к меропенему и/или имипенему.2.1.2.
Молекулярно-генетические методы исследованияВыделение ДНКДля выделения ДНК использовали суточную культуру, полученную припосеве на плотные питательные среды, указанные выше. Бактериальную ДНКвыделялиспомощьюкоммерческихнаборов«ГК-экспресс»(ЦНИИЭРоспотребнадзора) согласно инструкции производителя.
Полученные образцыхранили до использования при t - 20°С.Определение генетических маркеров резистентностиДля выявления генов БЛРС и карбапенемаз использовали метод ПЦР. Длявыявления генов БЛРС blaCTX-M и blaТЕМ были использованы праймеры,предложенные Edelstein M., 2003 (Таблица 2.2).
Общий объем реакционной смесисоставил 20 мкл, содержал 4 мкл ПЦР-микс с полимеразой горячего старта(5хScreenMix-HS, Евроген), по 2 мкл каждого из праймеров, 10 мклдеионизированной воды и пробы 2 мкл ДНК. Компоненты реакционной смесисмешивали непосредственно перед проведением эксперимента.Результаты реакции оценивали путем проведения горизонтальногоэлектрофореза в 2% агарозном геле.61Таблица 2.2Праймеры для идентификации генов blaCTX-M и blaТЕМ№ПраймерПоследовательность 5’ – 3’Продукт (bp)1CTX-M/F5’-tttgcgatgtgcagtaccag-3’5442CTX-M/R5’-gatatcgttggtggtgccat-3’3TEM/F5’-ataaaattcttgaagacgaaa-3’4TEM/R5’-gacagttaccaatgcttaatca-3’bla CTX-Mbla ТЕМ1080Реакцию амплификации проводили по схеме:1. Начальная денатурация - 94ºС – 1,5'2. Денатурация 94ºС − 10''Отжиг праймеров 54ºС − 10''.Элонгация 72ºС – 45''ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)Выявление генов, кодирующих продукцию карбапенемаз, проводили сиспользованиемнаборовсгибридизационно-флуоресцентнойдетекцией«АмплиСенс® MDR MBL-FL» (IMP, NDM, VIM), «АмплиСенс® MDRKPC/OXA-48-FL» (KPC, OXA-48), «АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL» (OXA-23,OXA-40, OXA-58), производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора.Проведение ПЦР-РВ включало в себя следующие этапы:1.Выделение ДНК (см.
выше)2.Амплификация с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме«реального времени»3.Анализ и интерпретация результатов62Общий объём реакционной смеси составил 25 мкл, включая 10 мкл пробыДНК. Компоненты реакционной смеси смешивали непосредственно передпроведением амплификации. В качестве положительного и отрицательногоконтролей использовали соответствующие образцы, входящие в состав набора.Реакцию амплификации проводили по схеме, указанной в Таблице 2.3.Таблица 2.3Программа амплификации ПЦР-РВ для выявления геновЦикл1Температура,оС9515 мин955сКоличествоциклов1Время30 сдетекция60235флуор.сигнала15 с72Результаты оценивали согласно инструкции производителя.
ОбразецсчиталиположительнымпризначенииCt≤32.Отрицательнымисчиталирезультаты с циклом порогового значения Ct>32.Мультилокусное сиквенс-типированиеДля генотипирования штаммов A. baumannii, P. аeruginosa, K. pneumoniaeиспользовали метод МЛСТ [93, 233, 310]. Использовали ДНК, экстрагированнуюизчистыхкультур.Подготовкаматрицдлясеквенированиявключалаамплификацию внутренних фрагментов генов «домашнего хозяйства», праймерыдля амплификации приведены в Таблице 2.4.63Таблица 2.4Праймеры для выявления «генов домашнего хозяйства» штаммовA.
baumannii, P. aeruginosa, K. pneumoniaeЛокусПраймерыНуклеотидная последовательностьПродукт(bp)A. baumanniiCitrato F1AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG TCC CCitrato R12GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA CACGgltAgyrB_FTGA AGG CGG CTT ATC TGA GTgyrB_RGCT GGG TCT TTT TCC TGA CAGDHB 1FGCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC CgyrBGDH SEC F594ACC ACA TGC TTT GTT ATGgdhB774GDHB 775RGTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG CGDH SEC RGTT GGC GTA TGT TGT GCRA1CCT GAA TCT TCY GGT AAA ACRA2GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT ACcpn60_FGGT GCT CAA CTT GTT CGT GAcpn60_RCAC CGA AAC CAG GAG CTT TAgpi_FGAA ATT TCC GGA GCT CAC AAgpi_RTCA GGA GCA ATA CCC CAC TCrpoD-FACC CGT GAA GGT GAA ATC AGrpoD-RTTC AGC TGG AGC TTT AGC AATrecA425cpn60640gpirpoD722456672P.
aeruginosaacsAACCTGGTGTACGCCTCGCTGAC842aroETGGGGCTATGACTGGAAACC825guaACGGCCTCGACGTGTGGATGA940mutLCCAGATCGCCGCCGGTGAGGTG940nuoDACCGCCACCCGTACTG1,042ppsAGGTCGCTCGGTCAAGGTAGTGG989trpEGCGGCCCAGGGTCGTGAG81164Продолжение таблицы 2.4ЛокусПраймерыНуклеотидная последовательностьПродукт(bp)K. pneumoniaegaprpoB(vic)gap_FAGACGAACGGTCAGGTCAACAgap_RAAAATCCGTGTTACCGCTGAArpoB _FrpoB _Rmdhmdh -Fmdh -Rpgipgi _Fpgi _RphoEphoE _FphoE _RinfBinfB _FinfB _RtonBtonB -FtonB -RSeqTGA AGG CGG CTT ATC TGA GT6621075GCT GGG TCT TTT TCC TGA CAGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAGTTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGCTTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGGTTGTGAGCGGATAACAATTTCTGATCAGAACTGGTAGGTGATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTCGCTGCTGGACTATATTCGTTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCTTTCAGCTCAAGAACTTCGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTTTATACCTCGGTACATCAGGTTTTGTGAGCGGATAACAATTTCATTCGCCGGCTGRGCRGAGAGSeq –FGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTASeq -RTTGTGAGCGGATAACAATTTC756566602462539Очистку ПЦР-продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров идНТФ проводили ферментативным разрушением с помощью экзонуклеазы I ищелочной фосфатазы (SAP, Affymetrix, США) при 370С в течение 30 мин.
споследующей инактивацией при 850 С.Секвенирование проводили с использованием наборов реагентов иоборудования фирмы Applied Biosystems (США) по методике, описаннойпроизводителем. Полученные в результате секвенирования нуклеотидныепоследовательности генов «домашнего хозяйства» обрабатывали с помощью65программыSeqMan,затемсравнивалисбазойаллелей,используяспециализированную программу для обработки результатов типирования,исследуемой аллели присваивался соответствующий номер.2.1.3. Исследование биопленокообразования у штаммов A. baumanniiФормирование биопленок на абиотической твердой поверхности оценивалис использованием сердечно-мозгового бульона (BHB; Becton Dickinson, США) поописанной ранее методике с модификациями [287]. Аликвоту (200 мкл) суточнойбактериальной культуры с мутностью 0,5 по Мак Фарланду вносили в стерильныекруглодонные пробирки объемом 5 мл (Falcon, Becton Dickinson, США),содержавшие 1,8 мл BHB с добавлением 1% раствора глюкозы.
После инкубации24 ч при температуре 370C без перемешивания бульон тщательно отбирали,пробирки дважды промывали 4 мл раствора Хэнкса. Для фиксации добавляли 5мл 4% раствора формальдегида и инкубировали 5 минут при комнатнойтемпературе. Далее пробирки промывали дистиллированной водой, добавляли 5мл раствора кристалл-виолета (1% раствор в 20% этаноле), (Sigma-Aldrich, США)и оставляли при комнатной температуре на 4 минуты.
После удаления красителякаждую пробирку промывали 4 мл дистиллированной воды 5 раз и высушивали.Связанный краситель растворяли и элюировали в 4 мл 95% этанола в течениечаса. Раствор красителя (200 мкл) переносили в прозрачный 96-луночныйпланшет (TPP, Швейцария) с последующим измерением оптической плотности(ОП) при длине волны 590 нм с использованием планшетного ридера Infinite200M (Tecan, Австрия). Все изоляты тестировали в двух повторах в трехнезависимых экспериментах; диапазон значений ОП использовали как меру ростабиопленок. Изоляты со значениями ОП ≥0,6 и <0,6 учитывали, как изоляты свысокой и низкой способностью к образованию биопленок соответственно.662.2. Выделение, идентификация и анализ респираторных патогеновStreptococcus pneumoniaeДанное проспективное исследование включило носоглоточные изолятыпневмококков,выделенныеотдетей,получавшихстационарнуюилиамбулаторную помощь в ФГАУ «Национальный научно-практический центрздоровья детей» Минздрава России в период с 2010 по 2016 гг.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
