Диссертация (1139571), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Пневмококкивыделяли из посева биоматериала носоглотки на колумбийском кровяном агаре сдобавлением 3% лошадиной сыворотки. Идентификацию проводили на основанииморфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста соптохином и реакции латекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit, BioMerieux,Франция). В 2010-2013 гг. капсульный тип определяли путем серологическоготипирования в реакции латексной агглютинации и/или реакции набуханиякапсулы по Нейфельду с использованием сывороток Statens Serum Institut (Дания),аначинаяс2014г.проводилимолекулярноетипированиеметодоммультиплексной ПЦР с последующим серологическим типированием редкихсеротипов[8].Нетипируемымисчиталипневмококки,которыенеагглютинировались ни одной из пуловых сывороток (пулы A-I и P-T).Чувствительность пневмококков к оксациллину (ОХА), эритромицину(ERY),клиндамицину(CLI),триметоприму/сульфаметоксазолу(SXT),хлорамфениколу (CHL) и тетрациклину (TET) определяли при помощи дискодиффузионного метода (диски Bio-Rad, США).
Результаты интерпретировалисогласно рекомендациям [33, 347]. В 2014-2016 гг. OXA-, ERY- и CLIрезистентные пневмококки дополнительно исследовали с использованием Етестов (BioMerieux, Франция). МЛУ определяли у изолятов, резистентных к тремили четырем АМП из числа PEN, ERY, CLI и SXT. У изолятов, устойчивых коксациллину, определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК)пенициллина (PEN) и амоксициллина (AMX). Пограничные значения МПК для67PEN, ERY и CLI определяли в соответствии с критериями EUCAST (Таблица 2.5),а для AMX использовали критерии CLSI [136].Таблица 2.5Критерии оценки чувствительности к антибиотикам EUCAST 2015АнтибиотикМПК (мг/л) EUCASTS.pneumoniaePEN4S≤0,06S.
pyogenesR>2AMX1,44APIS≤0,25R>0,25н/тн/т0,52н/тн/т0,52н/тн/тERY0,250,50,250,25CLI0,50,50,50,5SXT1212CHL8888TET12122222COX2,44VNC4ETP0,50,5н/тн/т4н/тн/т0,250,254н/тн/т0,250,25н/тн/т2419CLRAZM3,4SPNd, ммПримечание:1Чувствительность оценивается по МПК ампициллина2Эритромицин может быть использованн для определения чувствительности к азитромицинуи кларитромицину3Интерпретация результатов определения чувствительности изолятов к спирамицинупроводилась согласно стандартам комитета по антибиотикограммам Французского обществамикробиологов (CASFM-2012)н/т – не тестировали4PEN – Бензилпенициллин, AMX – Амоксициллин, API – Ампициллин, ERY – Эритромицин,VNC – Ванкомицин, ETP – Эртапенем, CLR – Кларитромтицин, AZM – Азитромицин, SPN Спирамицин68МПК антибиотика для 50% и 90% исследованных изолятов представляли ввиде МПК50 и МПК90 соответственно.
Наличие индуцибельной устойчивости кCLI у ERY-резистентных/CLI-чувствительных пневмококков регистрировали вслучае уплощения зоны подавления роста (D-феномен) вокруг диска с CLI,расположенного рядом с ERY-диском (расстояние между краями дисков 12-16мм).Детекцию генов резистентности ermB и mef у ERY-резистентныхпневмококков проводили при помощи ПЦР описанными ранее методами [7].Выявление генов, кодирующих пили типа 1 и 2 (PI1 и PI2)у пневмококков серотипа 19АПрисутствие островков, кодирующих пили (pilus islet, PI), типа 1 (PI1)определяли с помощью амплификации внутреннего фрагмента геномного регионаPI1 (также называемого островком патогенности rlrA) с использованием ранееописанных праймеров RLRA-F (5'-TCTGATAGATGAGACGCTGTTG-3') и RLRAR (5'-CTCCGCTTCTTTCTACTACAAG-3')30.
Для детекции PI2 модифицировалипраймеры, описанные Bagnoli31 (PI2-F: 5'-CGTGGGTATCAGGTGTCCTATG-3' иPI2-R: 5'-TGCAGTGAATAGCTTTTTAAAGAA- 3').Амплификация, секвенирование и генетический анализ геновpbp1a, pbp2b и pbp2xФрагменты генов pbp1a, pbp2b и pbp2x, кодирующих транспептидазныедомены ПСБ, амплифицировали методом ПЦР и секвенировали с использованиемметода Сэнгера [203]. На основании результатов секвенирования определялиаминокислотную структуру фрагментов pbp1a (позиции 341-582), pbp2b (позиции375-652)иpbp2х(позиции337-661).Полученныеаминокислотныепоследовательности сравнивали со структурой ПСБ эталонного штамма S.pneumoniae – R6, а также клонов Taiwan19F-14/ST236, Spain9V-3/ST156 и69MDR19A/ST320,используяописанныеранееучетныеномерапоследовательностей в базе данных GenBank [240]. Анализ аминокислотнойструктуры ПСБ и построение филогенетического дерева методом ближайшихсоседей проводили с помощью программного обеспечения [219].Streptococcus pyogenesДля посева использовали 5% кровяной агар.
Идентификацию S. pyogenesпроводили общепринятыми в микробиологии методами, используя диски сбацитрацином, реакцию латекс-агглютинации (Slidex strepto-kit, bioMerieuх) и наанализаторе MALDI-TOF MS (Microflex, Bruker Daltonics). Чувствительность кERY и CLI определяли диско-диффузионным методом (диски BioRad) на средеМюллера-Хинтон с добавлением 5% крови. У ERY-резистентных изолятов S.pyogenes, выделенных в 2014 - 2016 гг, МПК ERY и CLI определяли с помощьюЕ-теста, (bioMerieux, Франция). Интерпретацию результатов чувствительностиштаммов S.
pyogenes к антибиотикам проводили по критериям EUCAST, 2015[347] (Таблица 2.5). Результаты чувствительности S. pyogenes к азитромицину икларитромицину, полученные диско-диффузионным методом, интерпретировалипо МУК 4.2. 1890-04 [59] в связи с отсутствием соответствующих критериев встандартах EUCAST. Результаты определения чувствительности к спирамицинудиско-диффузионным методом трактовались согласно стандартам комитета поантибиотикограммам Французского общества микробиологов (CASFM-2012)[139]. К категории «нечувствительный» мы относили изоляты, обладавшиеумеренным и высоким уровнем резистентности.Статистические методыСтатистический анализ проводили с применением пакета IBM SPSSStatisticsfor Windows, версия20.0(IBM Corp.). Для анализа таблицсопряженности при сравнении долей использовали χ2 или z-критерий, где это70необходимо.Различиявбиопленкообразованиимеждуклональнымикомплексами и сиквенс-типами оценивали с помощью U-критерия КраскеллаУоллиса с последующим попарным сравнением методом Манна-Уитни (U-тест) споправкой Бонферрони для множественных попарных сравнений.
Различиясчитали статистически значимыми при р<0,05.71Глава 3. Госпитальные грамотрицательные бактерии3.1. Динамика микробиоты, колонизирующей слизистые оболочки во времяпребывания в ОРИТ, при анализе трахеального аспиратаСостав микробиоты, выделенной из трахеального аспирата во всерассматриваемые периоды, включал 235 изолятов на 136 проб. С наибольшейчастотой от пациентов, находящихся на ИВЛ, выделялись: K. pneumoniae (24,6%),A. baumannii (23,8%), P. aeruginosa (11,9), Ralstonia picketii (7,7%) иStaphylococcus aureus (7,2%). Долевое участие в микробиоте трахеальногоаспирата E. faecium и E.
coli составило 3,8% и 4,2% соответственно. На остальныевиды микроорганизмов, выделенных из трахеального аспирата с частотой от 0,5%до 2,5%, пришлось 14,8%.Анализ динамики колонизации слизистых респираторного тракта приисследовании трахеального аспирата проведенного по трем периодам пребыванияв ОРИТ, показал, что при поступлении в ОРИТ (I период) в совокупности быловыделено всего 37 изолятов, включавших K.
pneumoniae (27%), A. baumannii(29,7%), S. aureus (18,9%) и E. coli (13,5%). Во II периоде (3-5 сутки пребывания вОРИТ) в микробный спектр трахеального аспирата добавились и другиепредставители внутрибольничной микробиоты, такие как R. picketii (10,5%) и P.aeruginosa (9,2%). В этот же период уменьшилась в 2 раза (до 9,2%) частотавыделения S. aureus. В III периоде (>5 суток) практически исчез S. aureus (до2,4%, p<0,001), но увеличилось долевое участие в микробиоте P. aeruginosa (до16,4%, p<0,05). В то же время K.
pneumoniae (28,7%) и A. baumannii (22,1%) и вэтот период сохранили свое доминирующее положение внутри микробиотытрахеального аспирата (Таблица 3.1).72Таблица 3.1Спектр условно-патогенных микроорганизмов, выделенных из трахеального аспирата (2014 - 2016 гг)Период ичислоисследованийK.pneumoniaeA.baumaniiP.aeruginosaR.pickettiiIn=3710(27%)11(29%)1(2%)0IIn=4117(22%)18(23%)7(9%)8(10%)7(9%)IIIn=5835(28%)27(22%)20(16%)10(8%)Всегоn=13662(26%)56(23%)28(11%)18(7%)P.
aeruginosa: p I - II = 0,20 ; p I - III = 0,03;R. pickettii: pI - II = 0,04 ; p I - III = 0,07;S.aureus: pI - III <0,001;E. coli: p I - II <0,01; p I - III <0,02S.aureusE.ColiВсегоизолятовРостанет03718(48%)2(2%)12(15%)761(1%)3(2%)2(1%)12(9%)1229(7%)6(2%)5(2%)24(10%)23528(11%)E.faeciumS.maltophilia02(5%)1(2%)1(1%)3(3%)1(1%)3(2%)4(3%)6(4%)217(7%)10(4%)9(3%)75(18%) (13%)CandidasppДругиевиды73Профиль антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры,выделенной из исследованных локусовМониторинг антибиотикорезистентности проводился у представителейведущей группы патогенов, учитывая высокую частоту их циркуляции в ОРИТ.Результаты определения резистентности к антибиотикам у выделенныхштаммов грамотрицательной флоры (Таблица 3.2) выявили, что среди изолятов K.рneumoniae, A.
baumannii и P. аeruginosa резистентностью к меропенему обладали20,5%, 69,6% и 61,5% штаммов соотвествующих микроорганизмов. К эртапенемубыло резистентных 22,2% штаммов K. рneumoniae. На высоком уровнеопределялась резистентность к аминогликозидам у A. baumannii (96,4% - 56%), P.аeruginosa (80,6% - 69,2%) и K. рneumoniae (67,7% - 41,1%).Таблица 3.2Резистентность (в %) к антибиотикам грамотрицательных бактерий,выделенных от детей в ОРИТ в период 2014 -2016 ггK. pneumoniaeA. baumaniiP.
aeruginosaАнтибиотикиn%n%n%AMC14493,2----MEM7320,55669,63961,5IPM7320,55666,13964,1ETP922,2----CZD17379,41593,33871,0FEP6991,34595,63966,774Продолжение таблицы 3.2K. pneumoniaeA. baumaniiP. aeruginosaАнтибиотикиn%n%n%GMN7356,25696,43680,6AKN7364,45596,43969,2NTM7341,15676,83675,0TMN3167,75056,03969,2CIP7170,45598,23868,4Примечание: AMC - Амоксициллин/клавуланат, CZD - ЦефтазидимK.
рneumoniaeСравнительный анализ антибиотикоустойчивости штаммов K. рneumoniae,выделенных в 3 периода исследования (2014, 2015 и 2016 гг.), выявил рострезистентности к тестируемым препаратам в последний период. Наиболеезначимым было увеличение доли изолятов, нечувствительных к карбапенемам(меропенему и имипенему), которая поднялась с 16% до 47% p<0,05 в 2016, г. Заэтот же период отмечено возрастание уровня резистентности и к такимантибиотикам, как нетилмицин (с 20% до 82%, p<0,001), ципрофлоксацин (с 60%до 94%, p<0,01), ко-тримоксазол (с 60% в 2015 г до 82% в 2016 г, p=0,189).75Таблица 3.3Сравнительная частота (абс и %) нечувствительных к антибиотикамштаммов K.
pneumoniae, выделенных от детей в ОРИТв периоды 2014 -2016 гг2014Антибиотики201520162014-2016n%n%n%n%4/2516,03/319,78/1715/7320,54/2516,03/319,78/1747,0p I-III = 0,0347,015/7320,51/616,71/3--2/922,2--26/2989,615/15100,041/4493,216/2564,013/3141,912/1770,641/7356,220/2580,014/3145,213/1776,547/7364,45/2520,011/3135,514/1730/7341,117/2568,04/666,7-82,3pI-III=0,0001-21/3167,715/2560,019/2965,516/1750/7170,4ATM11/1-22/2395,616/17-94,1p I-III=0,01494,139/4195,1NFE1--22/2395,6--22/2395,6FOS----13/1776,413/1776,4SXT--12/2060,014/1782,326/3770,3MEMIPMETPAMCGMNAKNNTMTMNCIP-Примечание: 1ATM – Азтреонам, NFE - НитрофурантоинA.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
