Диссертация (1139516), страница 23
Текст из файла (страница 23)
pneumoniae1230,7S. epidermidis820,5P. aeruginosa820,5Candida albicansассоциации микроорганизмов:K. pneumonia+ S. epidermidisP. aeruginosa+ Candida albicans717,9225,15,15 мл крови из пупочной вены,соотношение крови и среды 1:10Примечание - достоверность различий между группами при (р ˂ 0,05)149Как видно из представленных данных,толькоуноворожденных были обнаружены в посеве микроорганизмы:39 (43,8%)S.
epidermidis(34,2%), K.pneumoniae (22,8%), P. aeruginosa (22,8%), Candida spp. (20%).У 4 новорожденных отмечались сочетания 2 микроорганизмов. Это былиассоциации K.pneumoniae и S. epidermidis у 2 новорожденных и P.aeruginosa с C.albicans также у 2 новорожденных. Однако только у 5 детей было совпадениебактериальных возбудителей в ТБА и крови, что составляло 26%.В проведенном в динамике заболевания бактериологическом исследованиибыло установлено, что из 93 (37,8%) новорожденных у 32 (34,5%) детейпроисходила смена возбудителя,обследованиявыделялсямикроорганизм,чтовкогда черезэтиологическисопровождалось6±1день после первичногозначимомухудшениемколичествеклиническогодругойтечениязаболевания. При этом наиболее часто выделялись: K.pneumoniae, S. epidermidis иP.aeruginosa.Как известно, патогенное действие на организм человека УПЭ проявляютпри прохождении патогенов через барьерные ткани, в том числе через слизистыеоболочки во внутреннюю среду в больших объемах, и еще, при резком сниженииобщего и местного иммунитета.При исследовании биологических свойстввыделенных штаммов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae быловыявлено, что все они обладали определенным набором факторов патогенности.К основным факторам патогенности (вирулентности) считают умениемикроорганизмовадгезироваться,иколонизироваться,резистентностькбиоцидным факторам макроорганизма, свойства инвазивности и токсигенности[62].Первичная идентификация с использованием комбинированных среддопускает квалифицировать только 4-5 культуральных признака, на основаниикоих однозначное решение о причислении культуры к конкретному роду непредставляется возможным.Для идентификации микроорганизмов - возбудителей ранних неонатальныхпневмоний, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение150биохимических признаков.
Несомненно, спектр биохимических показателейявляется в достаточной мере надежным признаком.В работе определялисахаролитические. протеолитические свойствабактерий, пигменто- и токсинообразование.Постановкойреакциигемагглютинациипроводилиисследованиеадгезивной активности УПЭ с эритроцитами человека. Посредством электронноймикроскопии было выявлено, что клетки штаммов К. pneumoniae, P. aeruginosa, E.coliобладаютвысокой адгезивной активностью ив большинстве случаевплотно прилегают к эритроцитам.Гемолитическую активность микроорганизмов изучали на чашках Петри ссухим питательным агаром и добавлением эритроцитарной массы.
Выделенныештаммы микроорганизмов, выделенные от новорожденных с РНПобладалиадгезивной и гемолитической активностью. Выделенные штаммы проявлялигемолитическую, желатиназную, уреазную активность.ШтаммыE.coliпродуцировали ДНК-азу, вырабатывали гемотоксин (на кровяном 5% агаре),лецитиназу.ШтаммыP.aeruginosaобладаливыраженнойгемолитической,гиалуронидазной, эластазной и фосфолипазной активностью (на ЦПХ-агаре).Выделенные штаммы микроорганизмов проявляли высокую ферментативнуюактивность.
Спектр биологических свойств представлен в Таблице 23.151Таблица 23Спектр биологических свойств, присущих бактериям семействаEnterobacteriaceae, выделенных от новорожденныхМикроорганизмПризнакСкоростьразмноженияРасщеплениеуглеводовГемолитическаяактивностьЛецитиназнаяактивностьДНК-азнаяактивностьПродукцияэнтеротоксинК. pneumoniae75/30,4%ОбычнаяP. aeruginosa42/17,1%ОбычнаяE. coli65/26,4%ОбычнаяСредняяферментативнаяактивностьЧащепроявляетсяВысокаяферментативнаяактивностьЧащепроявляетсяВыраженаЧащепроявляетсяЧащепроявляетсяЧащепроявляется++ВыраженаВыраженаВыраженаВыражена+Полученные результаты свидетельствуют о роли выделенных штаммовмикроорганизмов семейства Enterobacteriaceae в этиологии РНП новорожденныхОРИТН родильного дома ГБУ «РКБ».Следующий этап нашего исследования мы посвятили изучению факторовпатогенности доминирующего возбудителя неонатальных пневмоний - Klebsiellapneumonia на молекулярно-генетическом уровне.5.2.1.
Изучение факторов патогенности Klebsiella pneumoniae намолекулярно-генетическом уровнеВ последнее время ученые проявляют интерес кэнтеробактериямродаKiebsiellaspp.,поскольку,условно-патогеннымявляютсявладельцамиэкологической и биологической гибкости, и не исключено, что они в состоянииприобретать возможность долговременногоприсутствия в макроорганизме иоказываться поводом для развития различных заболеваний [154]. В качестве152одной из причин этого феномена рассматривают изменение патогенности этихмикроорганизмов [75].
Известно, что изменение патогенности у бактерийосуществляется на генетическом уровне посредством мутаций и генетическихрекомбинаций [154].Преимущественно значительными для трансформации патогенности УПЭ,ввидутенденциик«скачкообразности»изначимостиосуществляемыхпреобразований микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации,которыепредопределяютгеномнуюпластичностьEnterobacteriaceae,воплощённую через некоторые конкретные механизмы, аффилированные, вчастности, с «островами» и «островками» патогенности [75].
По литературеизвестно, по меньшей мере, 78 серотипов (К антиген, капсульный) для K.pneumoniae. Несколько серотипов (включая преобладающие К1 и К2) обладаютуникальнымгиперслизистым(гипервирулентным)фенотипомвследствиеповышенной продукции капсульного полисахарида (КПС), который считаетсяглавным фактором вирулентности K. pneumoniae и определяются по наличиюгиперслизистых колоний на чашке Петри. Степень слизистости положительнокоррелируетсинвазивностьюинфекционногоагента.Однакосвязьгипервирулентных штаммов с гиперпродукцией капсулы остается под вопросом,поскольку повышенное содержание полисахаридов может быть следствиемвключения полисахаридов из внешней среды, а не полисахаридов «истинногопроисхождения».Гипервирулентные штаммы K.
pneumoniae являются высоко инвазивнымиимогутпоражатьдажездоровыхиндивидов,приводякразвитиювнутрибольничных жизнеугрожающих инфекций, таких как пиогенный абсцесспечени,менингит, некротизирующийфасциит,эндофтальмититяжелаяпневмония. В частности, K1/K2-вызванный абсцесс печени часто осложняетсяметастатическимраспространениеминфекции.Этаособенностьявляетсяхарактерной для гиперслизистых штаммов K.
pneumoniae и не присуща другимграмнегативным бактериям.153В наших исследованиях был проведен анализ на наличие у K. pneumoniaeряда генетических показателей: allS (activator of the allantoin regulon gene), rmpA(Capsular polysaccharide biosynthesis gene), cf29a (Adhesion associated gene), Uge(Uridine diphosphate galacturonate 4-epimerase gene) и wabG (Core LPS biosynthesisgene), белковые продукты которых отвечают за адгезию и за синтетическиепроцессы (синтез капсульного полисахарида (КПС) и биосинтез ЛПС).Последовательности праймеров представлены ниже: allS_f - 5ʹ- CCG TTA GGCAAT CCA GAC -3ʹ; allS_r5ʹ- TCT GAT TTA ACC CAC ATT -3ʹ rmpA_f5ʹ- ACTGGG CTA CCT CTG CTT CA -3ʹ rmpA_r5ʹ- CTT GCA TGA GCC ATC TTT CA -3ʹcf29a_f5ʹ- GAC TCT GAT TGC ACT GGC TGT G -3ʹ cf29a_r5ʹ- GTT ATA AGTTAC TGC CAC GTT C -3ʹ uge_f5ʹ- GAT CAT CCG GTC TCC CTG TA -3ʹ uge_r5ʹTCT TCA CGC CTT CCT TCA CT -3ʹ wabG_f5ʹ- CGG ACT GGC AGA TCC ATATC -3ʹ wabG_r5ʹ- ACC ATC GGC CAT TTG ATA GA -3ʹ.
В наших исследованияхбыло показано, что у нескольких изолятов, полученных от новорожденных спневмонией выявлялись данные генетические маркеры.КПС K. pneumoniae является кислотным полисахаридом, который состоит восновном из 3-6 повторяющихся углеводов. КПС синтезируется по Wzyзависимому пути полимеризации, который хорошо описан для КПС 1 группы E.coli; кластеры гена cps состоят из генов, ответственных за ситнез полисахаридов,повторяющихся участков капсулы, их сбора и экспорта.
Общая длина гена cpsсоставляет от 21 до 30 kb, и содержит 16-25 генов. В области 5’-конца находитсякластер 6 консервативных генов (galF, orf2, wzi, wza, wzb and wzc), в области 3’конца- консервативные геныgnd и ugd. В центральной области находятсявысоко дивергентные гены, которые кодируют белки для полимеризации и сборкиКПС. Гены wzi и wzy представлены у всех K типов, которые, однако, имеютвариабельные последовательности у разных К типов. Следовательно, с помощьюwzy-направленного ПЦР анализа можно идентифицировать K1, K2, K3, K5, K20,K54, К57 и, более того, с помощью секвенирования wzi можно определить К типбольшинства клинических штаммов K. pneumoniae. Данный метод былиспользован для обнаружения новых капсульных типов K. pneumoniae.154Синтез КПС начинается со сбора отдельных единиц, состоящих изуглеводныхповторов,гликозилтрансфераз.которыеОбразующиесяподвергаютсяфрагментыдействиюразличныхтранспортируютсячерезвнутреннюю мембрану при помощи флиппазы Wzx и полимеризуются поддействием фермента Wzx полимеразы в околоплазменном пространстве.Дальнейшая полимеризация и экспорт сформированного КПС на поверхностьбактериальной клетки происходит за счет совместного действия Wza (тирозинаутокиназа внутренней мембраны), Wzb (протеин-тирозин фосфатаза), Wzc(интегральный липопротеин наружной мембраны).
Ген magA (wzyKpK1)кодирует капсульную К1-специфическую Wzy полимеразу, не влияет на синтезЛПС и был описан в экспериментально К1-индуцированной метастатическойинфекции, как важный фактор вирулентности K. pneumoniae.Ген rmpA и его изоформа rmpA2 имеют плазмидное происхождение икодируют белки, активирующие транскрипцию гена cps, отвечающие за синтезКПС и гиперслизистость К1/К2 K. pneumoniae. У К2 штамма CG43 оба, rmpA иrmpA2, участвуют в активации синтеза КПС и оказывают сильное влияние навирулентность у мышей.
У К1 штамма NTUH-K2044 помимо плазмидных геновrmpA и rmpA2 имеется также паралог rmpA на хромосоме, однако толькоплазмидные rmpA способны повышать транскрипцию гена cps.Учитывая, что ряд возбудителей K. pneumoniae, полученных от пациентов снеонатальной пневмонией, содержал генетические маркеры, продукты которыхотносятся к факторам патогенности возбудителя. А также, что по даннымлитературы известно, что капсула на поверхности K. pneumoniae защищаетбактерию от опсонизации и фагоцитоза макрофагами, другие факторы клебсиеллучаствуют в подавлении воспалительных реакций, а также возбудитель можетбыть резистентен к противомикробным пептидам, в дальнейших главахдиссертации представлен материал о влиянии K. pneumoniae на экспрессионныйпрофиль генов, белковые продукты которых участвуют во врожденномиммунитете.1555.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
