Диссертация (1139516), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В отдельном эппендорфе (0,6 мл)готовили смесь №1: 1 мкл Random-праймера [15 OE/мл] (шестичленныеолигонуклеотиды со случайной последовательностью), 1 мкл праймера Oligo(dT)[15 OE/мл] и 3 мкл ddH2O. Приготовленную смесь №1 раскапывали по пробиркампо 5 мкл на одну пробу. Добавляли 5 мкл РНК, а в пробирку с отрицательнымконтролем вносили 5 мкл ddH2O, перемешивали с помощью вортекса (МикроспинFV-2400, BioSan) и помещали в термостат «Термит» («ДНК-технология», РФ),Инкубировали 3 мин при температуре 75°С для проведения отжига праймеров.
Вотдельном эппендорфе готовили смесь №2 (MMLV-RT (50 ед/мкл) 1 мкл, 2,5ХРеакционная смесь 10 мкл, ddH2O 4 мкл). Пробирки после инкубации охлаждали83до 4°С и при 4°С в них вносили по 15 мкл смеси №2, инкубировали в термостатеследующем температурно-временном режиме: 37°С 40 мин, 95°С 10 мин.Полученную после проведения реакции ОТ кДНК хранили при температуреминус 70°С для дальнейшего проведения ПЦР-РВ.2.2.4.3. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времениДля определения экспрессии исследуемых генов использовали методполимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Реакциюпроводили с применением «Набора реагентов для проведения ПЦР-РВ вприсутствии SYBR Green I» и праймеров, синтезированных на фирме «Синтол»,РФ.
Системы для определения экспрессии исследуемых генов, были отработаныранее на кафедре иммунологии МБФ [24].Реакционную смесь готовили из реактивов «Набора для проведения ПЦРРВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I», (Синтол,РФ) иразносили в пробирки по 12 мкл, и добавляли по 3 мкл проб кДНК, полученных спомощью реакции ОТ. В качестве контроля использовали две пробы: реакционнаясмесь + dd H2O (К-) и реакционная смесь + отрицательный контроль реакции ОТ(ОТК-).Реакцию ПЦР-РВ проводили на ПЦР-амплификаторе (ДТ-96, «НПО ДНКТехнология», РФ) в температурно-временном режиме 95,0°С - 4 мин, (94,0°С – 20сек, Tm – 40 сек) 40 циклов.ПослепроведенияПЦР-РВполучализависимостиинтенсивностифлуоресценции от количества циклов амплификации.Определение количества копий исследуемых генов производился покалибровочным прямым, ранее разработанным на кафедре иммунологии МБФ[24].
Стандартизация результатов ПЦР-РВ, полученных в процессе исследования,проводили относительно уровня экспрессии гена β-актина.Для каждого образца получали значение логарифма числа копийисследуемого гена и числа копий гена β-актина для нормировки результатов.84Количествокопийопределяемогогенавдальнейшемпересчитывалосьотносительно 1 млн. копий гена β-актина.ПЦР-РВ для оценки полиморфных маркеров (-308G/A) в гене TNFА и (1082 A/G) в гене IL-10.Реакционная смесь состояла из компонентов «Набора для проведения ПЦРРВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия):1xBuffer+SYBR (1,5 мкл), 2.5 мМ dNTР (1,5 мкл), 25 мМ MgCl2 (1,5 мкл), 5 ед/мклTaq-ДНК-полимераза (0,3 мкл), Праймер прямой* 1 ОЕ/мл (1 мкл), Праймеробратный* 1 ОЕ/мл (1 мкл).
Общей объем смеси составлял 12 мкл, образца – 3мкл (50-500 нг).* для определения полиморфизма (-308G/A) в гене TNF-a и (-1082 A/G) вгене IL-10 приготовляли два микса.В первом в качестве прямого праймера использовали праймер дляопределения аллеля А, во втором - для определения аллеля G, в качествеобратного – общий для обоих смесей праймер.Реакция проводилась на амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия)по следующей программе: 94°С – 2 мин; (94°С – 30 сек, 61°С – 1 мин, 72°С – 1мин) 40 циклов; плавление (100 циклов - 90°С – 15 сек.).В результате реакции получали кривые зависимости уровня флуоресценцииот циклов амплификации.
Рост кривой ассоциировался с накоплением ПЦРпродукта в пробирке. Высокий уровень флуоресценции в одной из двух пробирокговорил о наличие только одного аллеля – гомозиготное состояние данногомаркера. Гетерозиготное состояние маркера наблюдалось в случае высокогоуровня флуоресценции в двух пробирках.Полиморфизмы в генах IL-10 (s01187-100, C-592A), IL-17 (s01171-100, G197A), TLR2 (01173-100, Arg753Gln), TLR4 (01285-100, Asp299Gly) выявляли сиспользованием соответствующего набора (НПФ «Литех», РФ) согласнопротоколу производителя. Метод основан на амплификации каждой аллелиотдельно, поэтому по окончанию реакции можно качественно оценить, какие из85аллелей присутствуют в образце и, тем самым, определить гомозиготный илигетерозиготный вариант по данному SNP в исследуемой пробе.Протокол реакции (на примере TLR4):1.Подготовить две пробирки типа Эппендорф, для приготовления смесидля Аллелей 1 и 2 соответственно.2.Внести в пробирки по 17,5μl разбавителя, 2,5μl реакционной смесидля соответствующей аллели, 1μl ПЦР-буфера с SYBR Green I, 0,4μlтермостабильной ДНК-полимеразы в расчете на 1 пробу.3.Раскапать ПЦР-микс по 21μl в пробирки для ПЦР и внести каждуюобразец в объеме 4μl.Результат проведенной реакции на примере одной пробы показан наРисунке 7.Рис.
7 Кинетические кривые ПЦР при определении полиморфизмаAsp299Gly в гене TLR4 в одном из исследуемых образцовА. Реакция с праймерами для Аллели 1. Рост кривой говорит об успешнойамплификации Аллели №1 (Asp).В. Реакция с праймерами для Аллели 2. Видно, что Аллель № 2 отсутствуетв данном образце, следовательно, генотип пациента по данному полиморфизму –Asp/Asp.862.2.5. Биоинформационный анализВ работе мы использовали программу Pathway Studio® и реферативнуюбазу данных ResNet® компании Ariadne Genomics (США). Объектами базыданных ResNet являются аннотации биологических объектов (в частности, белков,клеточных процессов и болезней), а также аннотации функциональных связеймежду ними, сформированные в результате обработки текстового массиваполнотекстовых статей и абстрактов, индексированных в Medline (совместно сос.н.с.
ЛМИ В.В. Соболевым)2.2.6. Статистические методы обработки данныхСтатистический анализпроводили с использованием общепринятыхстатистических методов, рассчитывая в группах данных:-среднее арифметическое (Х), Х=хi/n,-дисперсию (2), 2-=(хi-Х)2/n,-среднее квадратичное отклонение (х), х=(хi-Х)2/n, где хi–значениеварианта, n-число экспериментов.Применяли также компьютерную статистическую программу BioStat, атакже программу Excel. В таблицах и рисунках результаты представлены в видеХ. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерийСтьюдента (t), а также непараметрические методы статистической обработкиданных.
В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценкистатистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группахиспользовали непараметрический критерий Манна-Уитни [61].Для статистической обработки результатов по качественным признакам(полиморфным маркерами - сравнение частот аллелей и генотипов) использовалинесколько непараметрических критериев: критерий χ2 и точный критерийФишера.
Основой статистической обработки данных по полиморфным маркерам87был χ2 – анализ четырехпольных таблиц распределения аллелей, генотипов игаплотипов в норме и в контроле. Достоверными считались различия при p 0,05.Если в исследуемой группе количество значений было невелико, то менялиточный критерий Фишера. Нулевая гипотеза состоит в том, что между двумягруппами нет никакой связи, альтернативная гипотеза – что есть. Оценкастатистической значимости полученных отличий проводилась по формулам,приводимым в медико-биологической статистике [61].Помимо достоверности различия частот, вычисляли отношение шансов(OR),котороехарактеризуетрискзаболевания.Отношениешансоврассчитывается по следующей формуле (2):OR = A×D / B×C(2)A - число лиц с наличием признака среди опытной группыB - число лиц с отсутствием признака в опытной группеC - число лиц с наличием признака среди контрольной группыD - число лиц с отсутствием признака в контрольной группе.Если OR1, то, следовательно, существует положительная ассоциацияпризнака с аллелем (генотипом), OR1 – отрицательная ассоциация.
Если OR=1,следовательно, риск отсутствует. OR вычисляется с 95% доверительныминтервалом (CI), который представляет собой интервал, в пределах которого свероятностью 95% находится ожидаемое значение OR.88ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. КЛИНИКОРЕНТГЕНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕОНАТАЛЬНЫХ ПНЕВМОНИГоворя о клинике и диагностике неонатальной пневмонии, следуетподчеркнуть, что ранние клинические симптомы могут быть неспецифичны [34].Часто дети рождаются в критическом состоянии, требующем проведенияреанимационных мероприятий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
