Диссертация (1139516), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Они не имели соматических расстройств ибыли выписаны домой в удовлетворительном состоянии на 4 – 5-е сутки жизни.В процессе наблюдения за новорожденными проводилось клиническое илабораторное обследование, данные представлены в Таблице 2.68Таблица 2Клинико-лабораторные исследования новорожденных с пневмониями(n=579)ИсследованияКол-воСбор анамнезаЕжедневный осмотрРентгенография грудной клеткиБактериологический посев крови, мазков со слизистойзадней стенки глотки, трахео-бронхиального аспирата1758175815501760ПЦР диагностика ДНК возбудителей в режимереального времени1760Консультации специалистов14602.2.2. Рентгенологическое исследованиеВсем детям с подозрением на пневмонию проводилась рентгенографиягрудной клетки.
Оценивались следующие изменения в легочной ткани: усиление,острая деформация бронхососудистого рисунка, очаговые тени. Применяласьстандартная укладка.2.2.3. Микробиологические методы исследованияМикробиологическое исследование трахеобронхиальных аспиратов (ТБА),мазков со слизистой зева и крови, осуществляли стандартным количественнымметодомв соответствии с Приказами МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 «Обунификации микробиологических методов исследования» на широкий наборпитательных сред для выделения аэробных и анаэробных факультативныхмикроорганизмов: Эндо - для выделения E.сoli, ЖСА – для Staphylococcus spp.,ЦПХ-агар – Pseudomonas spp., Кандида-агар – для выделения грибов рода Candidaspp.,Клебсиелла-агар – для Klebsiella spp., Амфолан-агар - дляProteusspp.микроскопическоеКультуральнойисследованиедиагностикематериала.всегдаМикроскопиивыделенияпредшествовалоподвергались69фиксированные мазки, а также окрашенные по Граму и метиленовым синим.Идентификациювыделенныхкультурмикроорганизмовпроводилипоморфологическим, культуральным и биохимическим признакам.Забор биоматериала производился при поступлении ребенка в ОРИТН доназначения антибиотиков в асептических условиях в заранее подготовленныестерильныепробиркимикробиологическихифлаконы.исследованийВзятиеТБАосуществлялидляпутемвыполнениявведениявэндотрахеальную трубку 1 мл стерильного физиологического раствора споследующей аспирацией содержимого дыхательных путей.
Материал собирали ссоблюдением правил асептики: ТБА собиралив стерильные закрытыеконтейнеры, мазки со слизистой задней стенки глотки и других слизистыхоболочек взятые стерильным тампономпомещали в стерильную пробирку, всоответствии с действующими в настоящее время методическими указаниями.Интервал между взятием материала и его посевом не превышал 2 часов.Клинические пробы различного происхождения изучали согласно действующимнормативным документам.Бактериологическоеисследованиепроводилосьвлаборатории«Клиническая микробиология» ООО НПП «Питательные среды» г. Махачкалы.Идентификацию микроорганизмов проводили по общепринятым схемам сиспользованиемтипоспецифическихсывороток.Извзятогоматериалаодновременно с посевом готовили мазки с окраской по Граму и последующей ихмикроскопией с иммерсионным объективом.
Определяли степень обсемененностиматериала и спектр идентифицированных микроорганизмов.Количество микроорганизмов выражали в следующих единицах:1) количество колониеобразующих единиц на 1 стандартном тампоне(КОЕ/т) или в 1 мл биологической жидкости (КОЕ/мл) при микробнойобсемененности до 1000 клеток2) десятичный логарифм (lg) при микробной обсемененности 1000 и болеемикробных клеток на 1 тампоне или в 1 мл биологической жидкости.70Этиологически значимыми считали количество микробных клеток – 104 млдля ТБА, – 104 мл и выше для мазка со слизистой зева.Выделенные культуры микроорганизмов идентифицировали до вида наоснованиикомплексатинкториально-морфологических,биохимическихисерологических тестов.Для биохимической идентификации выделенных культур использовалимикротестсистемыдляидентификациистафилококков(МТС-S)идляэнтеробактерий (МТС-М12Е) производства НПО «Питательные среды» ФГУП«НПО«Микроген»(г.Махачкала)икомпьютернойпрограммы«Микротестсистемы в лабораторной диагностике».Идентификация энтеробактерий проводилась на основании биохимическойактивности с использованием тест-системы «МТС-М12Е».
Микротестсистемапредставляет собой набор из 12 субстратно-индикаторных сред для ускоренноговыявления биохимической активности энтеробактерий. Включает специфическиетесты определения утилизации цитрата, малоната, углеводов - глюкозы, лактозы,маннита,мальтозы,наличияфенилаланиндезаминазы,ß-галактозидазыиаргининдегидролазы, активности уреазы, обнаружения индола и сероводорода.Визуальное определение по изменению цвета субстрата при посеве исследуемыхобразцов.Набор реагентов позволяет за 18-24 часа инкубирования осуществитьидентификацию бактерий семейства Enterobacteriaceae по ферментативнойактивности микробиологическим методом: культуру выделяют из нативногоматериала на скошенном питательном агаре, смыв микробной суспензии вносятво все ячейки контейнера с дифференциально-диагностическими средами,анаэробныеусловиясоздаютстерильнымвазелиновыммаслом.Приположительном результате наблюдают изменение исходного цвета субстратов посравнению с контролем. Тест-системы «МТС-М12Е» и цветной указательпредставлены на Рисунке 3 и в Таблице 3.71Рис.3Биохимическая идентификация энтеробактерий с использованиемтест-системы «МТС-М12Е»Таблица 3Цветовой указатель для «МТС-М12Е»Тестыутилизация цитрата натрияутилизация малоната натрияналичиефенилаланиндезаминазыферментация глюкозыферментация лактозыферментация маннитаферментация мальтозыиндолобразованиеналичие β - галактозидазыналичие уреазыобразование H2SналичиелизиндекарбоксилазыВмировойПоложительнаяОтрицательная реакцияреакцияголубойСине-зеленый,желтый, зеленыйтемно-зеленыйбесцветныйжелтыйфиолетовое кольцокрасныйбесцветный, светлокоричневыйжелтыйбесцветныйРозовый, малиновыйСветло-желтыйЧерный, серыйОранжево-красныйжелтыйбактериологическойпрактикенарядусклассическимипитательными средами (Эндо и др.) для выделения и дифференциациимикроорганизмов, широкое распространение получили хромогенные питательныесреды (ХПС).72Для оптимизации и усовершенствования методов микробиологическойдиагностики пневмоний у новорожденных и, в частности РНП и ВУП уноворожденных, для бактериологического исследования клинического материаламы также в своей работе применяли экспериментальные образцы хромогенныхпитательных сред для прямого выделения и идентификации возбудителей.Хромогенные питательные среды (ХПС) для одноэтапного выделения иидентификации условнопатогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae (E.coli,Klebsiella spp., Proteus spp.): среда E.coli-coliform-Proteus хром агар для выделенияи прямой идентификации Е.соli, колиформных бактерий и протеев, а также средаКлебсиелла хром агар - для выделения и прямой идентификации клебсиелл.Сравнительнаяхарактеристикаклассическойсхемыбактериологическогоисследования и схемы с использованием ХПС представлена на Рисунке 4.73ТБА, мазки иззева и ВДП, кровьПосев на комплекс питательных сред,культивирование, выделение чистойкультуры микроорганизмовОпределение культуральных,морфологических, биохимических(сахаролитических,протеолитических), антигенныхсвойств.Посев наE.coliколиформProteus хромагарПосев наКлебсиелахром агарТесты наоксидазу, индолОпределение факторов патогенности(каталаза, плазмокоагулаза, ДНК-азалецитиназа.Посев нацитратныйагарПосев наКлиглер агарПостановкаантибиотикограммыРис.
4 Классическая схема бактериологического исследования и схема сиспользованием ХПСКаквидноизрисунка,такойподходпозволялускоритьмикробиологическую диагностику пневмоний с выделением патогена, чтосокращаловремяпостановкиантибиотикограммыиначалопроведенияэтиотропной терапии.Метод определения стафилококков (ГОСТ 10444.2 - 94)Из навески исследуемого продукта готовили ряд десятикратных разведений.Посев разведений производили на солевой бульон.
Посевы инкубировали в74течение 18-24 часов. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов кстафилококкам делали посевы на поверхность селективно-диагностической среды(желточно-солевой агар). Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение24-48 часов, после чего просматривали и отмечали рост характерных колоний.Нажелточно-солевомагареколонииS.aureusокруженызонойлецитиназной активности.
Для подтверждения принадлежности колоний к S.aureus отбирали не менее 5 колоний и пересевалина поверхность скошенногомясо-пептонного агара. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 24часов. У выросших микроорганизмов определяли отношение к окраске по Граму,способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу иферментировать маннит в анаэробных условиях.Желточно-солевой агар (ЖСА)В расплавленный и остуженный до 60С МПА pH 7,2 с 10% растворхлористого натрия прибавляют 10-20 процентов желточной взвеси в соотношении3:1.
Предварительно желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200мл физиологического раствора. Затем агар тщательно смешивают с желточнойвзвесью и разливают в чашки Петри.Лецитовителлазную активность оценивали при посеве культур на ЖСА.При наличии фермента вокруг выросших колоний регистрировали специфическийвенчик.Плазмокоагулирующую активностьК плазме крови кролика, разлитой по пробиркам, добавляли по одной петлеиспытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведённой плазмой в качествеконтроля незасеянной.
Внесённую культуру размешивали и помещали втермостат при температуре 37°С. Если через 6 ч коагуляции не происходило, топробирки оставляли при температуре 30°С на 24 ч. Если и через 24 ч плазма нескоагулировала,тоиспытуемуюкультурустафилококкакоагулазоотрицательной.Реакцию считали положительной, если:1. В плазме образуется небольшой компактный сгусток (++);относилик752. Образуется большой уплотненный сгусток (+++);3. Плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения приперевёртывании пробирки (++++).Для изучения ДНКазной активности суточную культуру засевали короткимштрихом на поверхность двухпроцентного подсушенного питательного агара,который помещали в термостат на 18-24 часа, затем поверхность агара заливали 5мл 3 моль/л раствора HCl. Через 2 минуты кислоту сливали и оценивалирезультаты – в случае появления вокруг культуры зоны просветления,превосходящей не менее чем в 4 раза зону роста бактерий, результат оцениваликак положительный.Каталазнуюактивностькультуроценивали следующим образом: ксуточной культуре добавляли равный объем свежеприготовленной 5%-нойперекиси водорода.
При наличии фермента каталазы перекись водородаразлагается с образованием пузырьков газа.Гемолитическую активность культур исследовали на кровяном агаре с 5%эритроцитов человека или кролика. Учет проводили через 24-48 часа по наличиюзон полного или неполного гемолиза вокруг выросших колоний.Ферментация маннита в анаэробных условияхСреду с маннитом разливали в пробирки по 10 мл, стерилизовали. Передпосевом среду освобождали от воздуха (пробирки кипятили в водяной бане притемпературе 100°С 10 мин.), затем быстро охлаждали в ледяной воде инемедленно производили посев уколом. Сверху заливали расплавленныйводной2%агар слоем 2-3 см, чтобы исключить попадание воздуха.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
