Диссертация (1139516), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Посевытермостатировали при температуре 37°С в течение 4 суток. Результаты считалиположительными, когда нижние и верхние части среды чётко изменяли цвет сзелёного на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируются какStaphylococcus aureus. Данные представлены в Таблице 4.76Таблица 4Идентификация стафилококков (Медицинская микробиология, вирусологияи иммунология, 2016)ПризнакиS. aureusS. epidermidisS. saprophyticusМорфология,окраска по ГрамуМелкие коккиГрам (+)КоккиГрам (+)Крупные коккиГрам (+)Реакцияплазмокоагуляции+––Ферментация маннита ванаэробных условиях+––Примечание - (+) – реакция есть; (–) – реакции нетОпределение чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.Диско-диффузионный методДля определения чувствительности бактериальных культур к антибиотикамиспользовали коммерческие диски (НИИЦФ, Санкт-Петербург) с определеннымиконцентрациями антибактериальных препаратов пяти функциональных классов:беталактамы - ампициллин (10 мг/л), тикарциллин (75 мг/л), тикарциллин/клавулановая к-та (75/10 мг/л), цефаперазон (75 мг/л), цефотаксим (10 мг/л) ицефтазидим (30 мг/л), меропенем (10 мг/л); аминогликозиды - гентамицин (10мг/л), стрептомицин (10 мг/л), нетилмицин (10 мг/л), миноциклин (30 мг/л),амикацин (10 мг/л); тетрациклины - тетрациклин (10 мг/л), доксициклинагидрохлорид (10 мг/л); фторхинолоны - ломефлоксацин (10 мг/л), норфлоксацин(10 мг/л), офлоксацин (5 мкг/мл); фениколы - хлорамфеникол (10 мг/л).Определениечувствительностикантибиотикамштаммовбактерийпроводили при использовании диско-диффузионного метода.
Для этого засевалигазон 100 мкл бактериальной суспензии, эквивалентной стандарту мутности 0,5по McFarland и содержащей примерно 1,5 х 108 КОЕ/мл бактериальной культуры,77и выкладывали на поверхность агара целлюлозные диски, содержащиеантибиотик. После инкубации чашек в термостате при 37ºС в течение 18-24ч.учитывалирезультатпутемизмерениядиаметразонызадержкиростабактериальной культуры вокруг диска в мм. Антибиотикограмма представлена наРисунке 5.Рис.5 Определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионнымметодомСанитарно-бактериологическое исследование объектов внешней средыи медперсонала родильного домаСанитарно-микробиологическоеисследованиепредметовобиходаиокружающей обстановки проводили для осуществления контроля за общимгигиеническимсостояниемиопределенияфекальнойзагрязненностииконтаминации патогенными микроорганизмами объектов окружающей среды каквозможных факторов при передаче возбудителей инфекционных болезней.Для оценки санитарного состояния отделений родильного дома определялизагрязненность медицинсткого оборудования и рук персонала.78Бактериологическое исследование смывов с ВДП и рук медперсоналаИз ВДП материал забиралинатощак или через 2 часа после едыстерильным тампоном со слизистой оболочки или ее пораженных участков.
Смывс поверхности рук проводилиувлажненным стерильным ватным тампонами.Смывы делали с обеих рук, тщательно протирая ладони, межпальцевые иподногтевые пространства. Затем тампон помещали в пробирку со стерильнойводой или физраствором, в котором его тщательно прополаскивали.Из исходного смыва делали посевы на чашки Петри с МПА (на общеебактериальное загрязнение) и на среду Эндо (на наличие БГКП). Посевывыдерживали в термостате при температуре 37С в течение суток. Из колоний,характерных для БГКП, готовилимикроскопировали,мазки, окрашивали их по Граму,при необходимости дополнительно идентифицировали пообщепринятым тестам для БГКП.Бактериологическое исследование смывов с поверхности предметовВзятие смыва осуществляли при помощи стерильного ватного тампона илистерильной марлевой салфетки.
Непосредственно перед взятием смывов тампоны(или салфетки) смачивали в пробирке со стерильной водопроводной водой (2 мл).После тщательного протирания исследуемого объекта смоченным тампоном (илисалфеткой) его помещали в ту же пробирку. Смывы с поверхности рабочихпанелей аппаратуры и оборудования ОРИТ делали с помощью трафаретов(шаблонов) из проволоки, имеющих площадь 25 см2 (100 см2). Трафареты передвзятием смывов стерилизовали над пламенем горелки, затем накладывают наисследуемую поверхность и с площади, ограниченной шаблоном, производятсмыв тампоном (или салфеткой).В пробирку после взятия смыва добавляли 8 мл стерильной воды, в которойтщательно прополаскивают тампон. Из исходного смыва делали посевы на МПАи среду Эндо.Смывы исследоваличисло) и на наличие БГКП.на общее бактериальное загрязнение (микробное79Исследование микрофлоры воздушной среды проводили с использованиемаппарата Кротова.
Метод Кротова является более точным количественнымметодом определения микробного числа воздуха с помощью специальногоприбора. Для подсчета КОЕ микроорганизмов в работе использовали чашкиПетри с сухим питательным агаром (СПА). На аппарате устанавливали отметкув 2,5 л/мин и пропускали 100 литров воздуха в течение 4 минут. Дляопределения стафилококковой обсемененности использовали чашки Петри сжелточно-солевым агаром (ЖСА), для этого, на отметке в 2,5 л/мин в течение 10минут пропускали соответственно 250 литров воздуха.Расчет микробного числа производили по формуле (1):Х = А × 1000 / V(1)Х - количество санитарно-показательных микроорганизмов в м3 воздуха;А – количество микробных колоний, выросших на чашке Петри;V – объем пропущенного через прибор воздуха в литрах;1000 – искомый объем воздуха2.2.4. Методы, используемые для диагностики показателей иммунитетаИммунологическоеисследованиебиоматериалаотноворожденныхпроводили в лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИ вакцин исыворотоким.И.И.Мечникова»РАМН (заведующая лабораторией, чл.-корр.РАН, д.м.н.
О.А.Свитич) с использованием стандартных тестов. Схемаиммунологического исследования представлена на Рисунке 6.80Рис. 6 Схема иммунологического исследованияПроспективное исследование проводилось в строгом соответствии сэтическими нормами «Хельсинской декларации» (WMA, 1964) и «Декларации ополитике в области обеспечения прав пациента в Европе» (WHO/EURO, 1994).2.2.4.1. Выделение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК)Получение биологического материала для последующих исследованийосуществлялось путем соскоба эпителиальных клеток слизистой оболочкиверхних дыхательных путей новорожденных и родильниц, в также крови.Для определения уровня экспрессии генов в группе здоровых доноров заборэпителиальныхклетокслизистойоболочкиверхнихдыхательныхпутейноворожденных (из зева).
Образцы клеток собирались с помощью цитощеточки ипереносились в 1,5 мл пробирки типа «Эппендорф» с содержащимся в нихлизирующем раствором (ИЛС, РФ). Образцы хранили при температуре минус700С. Материал эпителиальных клеток в последующем использовался для81определения генетических маркеров, а также для оценки уровня экспрессииисследуемых показателей врожденного иммунитета.Из клинического материала выделяли ДНК и РНК методом аффиннойсорбции на частицах силикагеля, используя набор «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб»(ИнтерЛабСервис, РФ) строго в соответствии с протоколом.Протоколвыделения:лизирующийрастворпрогретьдополногорастворения кристаллов при 65°С на термостате «Термит» («ДНК-технология»,РФ) и внести в промаркированные пробирки по 450 мкл лизирующего буфера и100 мкл образца. Содержимое пробирки перемешать на мини-центрифугеМикроспин FV-2400 (Латвия), процентрифугировать 5 сек при 5000 об/мин намикроцентрифугеHighSpeedMiniCentrifuge(Германия).По25мклресуспензированного сорбента добавить в каждую пробирку, перемешать иосадить на микроцентрифуге в течение 30 сек при 10 тыс.об/мин.
После этогонадосадочную жидкость удалить. В пробирки добавить по 400 мкл раствора дляотмывки 1, перемешать до полного растворения сорбента, процентрифугироватьпри 10 тыс. об/мин 30 сек. и удалить надосадочную жидкость. Добавить впробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, перемешать до полногоресуспензирования сорбента, процетрифугировать при 10 тыс.об/мин 30 сек иудалить надосадочную жидкость. Данную отмывку производить дважды. По 400мкл раствора 4 добавить в пробирки, перемешать до полного растворениясорбента,процентрифугироватьпри10тыс.об/мин30секиудалитьнадосадочную жидкость.
Далее осадившийся в пробирках сорбент подсушить втермостате при 60°С 15 минут, крышки пробирок должны быть открыты.Добавить в пробирки по 50 мкл элюирующего-буфера, перемешать и поместить втермостат на 2-3 мин при 60°С. Перемешать и процентрифугировать пробирки намаксимальных оборотах в течение 1 мин.Полученная надосадочная жидкость содержит очищенные как ДНК, так иРНК клеток.
Полученный материал хранится при температуре минус 70°С.82Концентрацию полученных нуклеиновых кислот и их чистоту оценивали спомощью микроспектрофотометра NanoDrop 2000, позволяющий проводитьбыструю проверку концентраций и качества образцов нуклеиновых кислот.Далее на полученных образцах РНК проводилась реакция обратнойтранскрипции (ОТ) для получения кДНК с использованием фермента ревертазы,а следующим этапом проводится ПЦР амплификация для определения уровняэкспрессии исследуемых генов.ДлягенетическихисследованийиспользовалиДНК,накоторойнепосредственно ставили реакцию ПЦР-РВ.2.2.4.2.
Реакция обратной транскрипцииРеакцию обратной транскрипции проводили с использованием «Набора дляпроведения реакции обратной транскрипции» (Синтол, РФ) для синтеза первойцепи ДНК на матрице РНК интересующего гена для последующего определениячисла копий с помощью ПЦР в реальном времени.Общий объем реакционной смеси на одну пробирку составил 25 мкл. Вкачестве отрицательного контроля в пробирку добавляли деионизированную воду(ddH2O), входящую в состав набора.Постановка реакции ОТ проводится в два последовательных этапа сприготовлением смеси №1 и смеси №2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
