Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 76
Текст из файла (страница 76)
Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с никол>, для чего кюкдь>й из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу 1П длиной по 8 — 10 пар пуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов 1, П и П1 ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков АМР (АТР или ХАРг) приводит к сшиванию олнгопуклеотидов 1 и П. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающил>и одноцепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды 1у и )>, частично перекрывающие выступающие 3'- и 5'-концевые фрагменты 1 — 11 нуклеотида.
Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды 1 — П, П1, ГТ 298 и У, ДНК-лигазой приводит к устрапепшо двух ников и образованию двуцепочечной структуры, состоящей из олигону>свеотидов ! — ! ! и 17 — 111 — У с выступающими одпоцепочечпыми фрагментами. Очегшдпо, что процесс мам>но повторять до тех пор, пока пе будет получена Д! ! К требуемого размера. Дальнейшие манипуляции с синтетическими генамп подробно описаны в 1 7.!1. Олигорибонуклеотнды мод>по получать синтетически, используя оба метода, как фосфитамидный, так и !1-фосфопатпый, и сиитопы, содержащие обратимо защищенную 2 'ОН вЂ” группу. В качестве прплгера можно привести синтов (114), у которого 2'-0Н-группа защищена теграгидропиранильным остатком: 114 Эта защитная группа достаточно стабильна, выдерживает все промежуточные обработки во время роста олигопуклоотпда н легко удаляется по завершении синтйза.
Для синтеза достаточно длинных палприбопуклеотидов пшроко используют транскрипцию предваритезыю синтезированных ДНК-дуплексов нужной структуры. Эти дуплексы снабжаются промоторалгп для используемой при транскрипции РНК-полимеразы, а следующая,за прол>оторол> трапскрибпругмая последовательность комплемента|гна тргбуелгой последовательности в соэдаваечой РНК. Наиболее широко используются РНК-полимеразы фатов Т7 и 5!г!> (хозяином этого фага является Тур!>!Ниглшм вп!а>опс! !а).
Этп полпмеразы позволнют получить до нескольких тысяч РНК-копий иа каждую ДИК-матрицу. По мере того как становятся доступными в количествах, достаточных для серьезных биологических исследований, различные ипдивпдуальныг белки, расширяется видимый спектр их важных практических приложений. В предыдущих параграфах уже упоминались инсулин, необходимый многочисленным пациентам; страдающим диабетом, и нуклеазы, оказавшиеся аффективными пра>ивов»руспымн препаратами. Этот перечень мам>от быть продолмгеи.
Оп в>сл>очанг горлюп роста, который открывает перспективы существенного иовышгшш ирадуктпвпости животноводства; группу родственных белков, известных под названием иптерферонов, которые вырабатываются в организма человека и мипютиых прп ш>русной инфекции и введение которых в организм прп заболевании и при эпидемиях данг существенные лечебные и профилактические результаты; ряд белков, стилгулирующих определенные этапы иммунного ответа, пю>ример пптарлейкипы, и т.д.
Весьма многообещающим для профилактики вирусш,>х заболеваний выглядит создание так называемых субъедипичиых вакцин, состояпо>х из вирусных белков не содержащих нуклепновай кислоты. Вирусные белки явля>отся главными, если не единственными, вирусными антигеиами, т.е. имешю на них вырабатывается иммуиный ответ.
Два наиболее широко исиользуемых тина нротнвовирусных вакцин представляют собой либо так называемые живые внкцины, либо инакти вированный вирус. В первом случае речь идет о способных размножаться в орга иизме пациента вирусах, структура которых изменена таким образом, что они стимулируют образование антител нротив вируса, но не вызывают заболевания или вызывают его в облегченной форме. Классическим примером является вирус осповакцины, на протяжении более ста лет использовавнишся для создания у людей иммунитета против черной ослы. Получены живые вакцины н против некоторых других опасных заболеваний, например полиомиелита. Однако в случае живых вакцин сохраняется опас~ость их нсрерождешш в сильные патогены, Наиболее распространенными являются вакцины, полученные нпактивацией вирусов путем их облучения или химической обработки, например формальдегидом.
Обработка проводится с таким расчетом, чтобы вирус потерял инфекционные свойства, но еще сохранил способность вызывать иммунный ответ. Поскольку возможность сохранения неизменных вирусных частиц должна быть полностью исключена, обработка делается с определенной избыточностью, что резко снижает способность модифицированного вируса стимулировать образование полноценных антител. Использование вирусных белков, свободных от вирусной нуклеиновой кислоты, полностью сшшает как опас~ость перерождения, твк и необходимость какой-либо оГ>работки белков, а тем самым и потери сннхсения их иммуногенности. Однако существующие способы производства белков, а иногда и их источники в ряде случаев малодоступны.
Так, белки, используемые в медицине и предназначенные длл введения и организм человека, должны, как правило, быть человеческого нроисхождения. В противном случас они люгут содерлсать чужеродные антигенные детерминанты и вызывать иммуииый ответ. Их многократное применение может вызвать сильную аллергическую реакцию, вплоть до шока и гибели человека. Даже такой небольшой и поэтому облвдюощнй чрезвычайно слабыми антигенными свойстввлш белок, как бычий инсулин, в отдельных случаях оказывается неприемлемым для многократного оримененпл, и среди больных диабетом существуег прослойка, неболыиая в процентном отношении, но весьма значительная в абсолютном вы(иохекии, которая нунинкчтя в ~елопеческом инсулине.
Между тем естественным источником человеческого инсулина может служить лишь трупный матс!ндал. Человеческий интерфсрои получюот из лейкоцитов, т.е. его природным источником мовсег служить только донорская кровь, что делает нроизводство ннтерфорона весьма дорогостоящпьь 11екоторые практически значимые белки, например гормон роста, содер катся в соответствующих тканях в таком ничто~кием количестве, что выделение их в производственном масштабе крайне нетеяюлогично.
Вирусные белки можно получать нэ вирусов, отделяя тем или иным путем нукленновые кислоты, ио это требует наработки значительных количеств вируса, что соиря>кено с высокой вероятностью заражения работников такого производства В связи с этим в середине 70-х годов в биотехнологии начало пнтенсивг развиваться новое направление, предусматривающее создание биологически объектов для производства белков животных и человека вне этих организмов основанное на введении генов, нрограммируюнцнх соответствуюнгие белки, в ген тические структуры одноклеточных, в первую очередь бактерий, Это потребовал ЗОО конструирования специальных молекул ДИК, несущих целевой ген и одновременно с способных размио~каться вместе с бактернальными клетками, чаще всего в клетка .
етках Есо11, и при этом экспрессироввть заложенную в них генетическую инч ор формацию. Такое направление биотехнологии получило название ~екенгичесхов внжснерии, а создаваемые ДР!К получили название Рехо~ибивашпнмг ДНК. Менее чем за 20 лет генетическая инженерия превратилась в огромную область человеческого знания и его практической деятельности. В рамках общего курса биохимии можно дать лишь некоторые основные представлеиил об этой области, Чтобы создавать рекомбинантные ДПК, несущие лселаемый ген, необходимо пр ежде всего располагать этим геном. Для этого используют три основных способа.
Во-первых, если известна первичная структура белка, получение которого желательно осуществить методами генетичаской инх;енерин, можно, основываясь иа генетическом коде, построить нуклеотидную последователь~ость, программирующую этот белок, и осуществить химико-ферментативный синтез гена. Так, например, были осуществлены синтезы нескольких гонов, кодирующнх различные интерфероны, Во-вторых, мо'кно выделить из тканей, в которых происходит экспрессия гена, информационные РПК, среди которых доллсиа присутствовать и мРНК, кодирующая необходнмьил белок, провести с помощью обратной транскриптазы синтез хожнле:нектарной Д1НР (сокращенно кДНК) и перевести ее в двунитевую структуру с помощью Д(1К-полиморазы. Можно, наконец, вырезать желаемый ген непосредственно нз ДПК того объекта, белок которого собираются иродуцировать.
Два последних подхода не даот сразу ~ко индивидуального гона и требуют предварительного отбора нз сложной смеси кД(1Е или фрагментов хромосомной Д1! К. Эта проблема решается ух% иа уровне клеток микроорганизмов, в которые введены новые наследственные ирограммы, и кути ее решения будут изложены несколько ин;ке. После того как исследователь получит материал, содержщцнй интересуюший его ген, он должен ввести его в состав специальных молекул ДПК, которые способны проникать в клетки и автономно разм~ожаться в составе этих клеток.
Такие молекулы ДНК получили название векторных молекул или просто аехглороо. В качестве векторов используют чаще всего две группы объектов: олазмиды и вирусы, в том числе бактернофаги. с!осло векторов, используемых в генетической инженерии, весьма велико, и ознакомиться с ними моли о в специальных руководствах по генетической инженерии. Основные элементы используемой в генетической инженерии методологии изложены нами на примере широко используемой плазмиды РН1!322, разином;аюшейся в клетках Его! 1. Эта илазмидв придает бактериальным кчеткам устойчивость к двум антибиотшсам — амцицнллину и тетрациклпну, поскольку содер,хит гены, програмлшрующие специальные ферменты, которые катализнруют нрсвршцоние этих антибиотиков и нетоксичные для клетки вещества. Эта устойчивость играет вюкиую роль цри последующих генно-инженерных ма~цпуляциях Чтобы встроить ген в кольцевую нлазмиду, последнюю превращают в лниейиую двунитевую Д)!К обработкой какой-либо эпдоцуклеазой рестрикции (см.
! 7.8), специфичной к единственному участку нлазмиды и ьатализнрующей ее Расщепление в одном из генов устойчивости к аитнбнотзиснм. В случае нлазмиды Р%322 зто можно, например, осуществить с помощью эидопуклеазы Рэс1, специфичной к последователыюстп.— ~1(рСрурбрСрйрС)- и катвлиэирующей гидролиз фосфоднэфнрной связи между остатками дезокснадеинлата и дезокснгуаинлата 301 г ! Р»»р»*»»» З~р г ~»»в ю-~»»с Р ОН НО~в ССССС-О НО-ССССС р ОТС,,О РО Стесд-ОН ОН < ОН -ТОСдрО ОН < Анкиюляы»р»»» < хб > днтф <~т !дни-л „, т»т АИХ-ляг»»» Рис. 8 .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
