Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Эта структура в один прием считывается с геля, причем прн достаточной длине дорожки геля одновременно может быть определено расположение сотен мономерных звеньев. Идеализированная схема такого разделения и определяемая последовательность приведены на рис. 77. 278 Метод расщепления, используемый при секвенированин по Максаму — Гилберту, основан на реакции расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по остаткам, лишенным гегероцикла, т.е.
по апурнновым или апиримидиновым фрагментам. Это расщепление проходит в присутствии оснований по схеме Π— Р~~ 1 О о в "о о о (во. /б7' -О'~0" Он ., + г)н ~ — /~н в (вн 3 О + хф -Е 'о-~ ва, +в' н о н~~нн О- Нне О— ЙН2 279 (здесь  — катализирующее основание). Оба разрыва являются процессами Р-элнминации, т.е, элнмннации радикала, находящегося в д-положении к полярной двойной связи О=О или к системе сопряженных связей С=С вЂ” С=Э.
Процесс в равной степени может проходить, если вместо ельдегидной группы находится гндразонная -СН=йх — Ф1Нь Практически для получения апуриновых и апиримидиновых сайтов в ДНК используют три типа превращений — метилирование днметилсульфатом, обработку муравьиной кислотой и реакцию с гидразингндратом.
Реакция с диметилсульфатом при рН 3,5 приводит к влкилированию атома В7 остатков гуанина, которые, приобретая положительный заряд, облегчают атаку водой гликозидного атома С1': а б б (!2) . )7) Рис 78. Радиоавтограф геля. полученного методом Мак<яма-Гипбе та и прочитываемая по этому гелго последоват<щьногть селвенировннного кым А.Г. Г!четнева) у <ветка кДНК-фрагмента генома вируса гщещевого энц ф ( ефалита (по дан- 8 = 72<у -ддТТФ 8 = Суь — ддЦТФ 8 = Ас!е - дд АТФ 8 биа-ддГТФ О О 0 (! -О-Р-О-! О-Р-О О В ! ! ! ~ у "О "О О а а б а а б б с с т с т о б * б и с 2Я! В 667а-ной муравьиной кислоте протонируются как остатки гуанина, так и остатки адеиина, в результате чего происходит апуринизация по обоим типам гетеро- циклов.
При последующей обработке пиперидином происходит расщепление цепи в первом случае только по остаткам дезоксигуанозина, во втором — по обоим пуриновым нуклеотидам. В итоге при радиоавтографии геля на первой дорожке выявляются все остатки, соответствующие гуанинам, на второй — и гуанинам и аденинам. Очевидно, что этой информации достаточно, чтобы раздельно определить положения в цепи обоих пуриновых нуклеотидов.
Обработка гидразингидратом приводит к расщеплению пиримидииового кольца с последующим замещением остатка мочевины на остаток гидразина и изомеризацией его в гидразон: Ф ~МН2 о м~ д2 як!Низ МНСОМН2 2 ~Фее 2 мн М аавмн о Реакция проходит как по остаткам цитозина, так и по остаткам тимина. Однако в щелочной среде (0,1М КОН в гидразингидрате) реакция по дезокситимидиновым фрагментам подавляется и модификация проходит только по остаткам дезоксицитидина. Это позволяет получить картину распределения остатков обоих пиримидиновых нукпеотидов и отдельно — деэоксицитидиновых звеньев.
Этой информации достаточно, чтобы определить положение раздельно по каждому из пиримидиновых нуклеотидов. На рис. 78 приведены радиоавтограф геля, полученного методом Максама — Гилберта, и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного полинуклеотида. Изложенный метод с точки зрения канонов классической аналитической химии противоестествен.
Для установления структуры гомогенного полинуклеотида его превращают в чрезвычайно сложную смесь фрагментов. Но именно это дает возможность после проведения электрофореза с одного геля сразу прочесть структуру, состоящую из многих десятков, а в некоторых случаях даже иэ нескольких сотен звеньев. Это связано со спецификой объекта — биополимера, построенного из большого числа заранее изученных и не слишком разнообразных, структурных элементов. В принципе тот же подход может быть использован для установления структуры РНК с той существенной разницей, что описанные для ДНК химические 280 Члектрофорез проводился в 4%-ном полиакриламиднам геле в присутствии З копь/л раствора мочевины.
Над дорох<кам*, в которых проводилось разделе- ние 22Р-меченного фрагмента после селективного расщепления по гетероциклам, указано, по каким нуклеотидам проводилось расщепление методы для расщепления по звеньям определенного типа в случае РНК неприменимы. Однако для РНК известны ферменты, расщепляющие полирибонуклеотидную цепь по определенным типам нуклеотидов, так что общаи методология мож~т быть использована и в этом случае. Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сантера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В его основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК-полимеразы.
Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. В своем оригинальном варианте метод заключается в использовании исследуемой ДНК в качестве матрицы для ДНК- полимеразы 1 из Е.со)2, или, точнее, так называемого фрагмента Кленова, который получают иэ ДНК-полимеразы 1 после протеолитического отщепления домена, ответственного эа 5 '— 3 -экзонуклеазную активность. При этом в реакционную смесь вместе с четырьмя дезоксирибонуклеозид-5 '-трифосфатами (дНТФ) добавляют один из 8',5'-дидезоксирибоиуклеозид-5'- трифосфатов (ддНТФ): Необходимо также добавление праймера (см.
8 5.1), комплементарного некоторому участку исследуемой матрицы. Структура участка должна быть заранее установлена, этого можно достигнуть, например, анализом последовательности нуклеотидов небольшого фрагмента исследуемой ДНК методом Максама— Гилберта. В такой системе начинается удлинение праймера, т.е. синтез а а с а а с а а а с а с с а а а с б а б т а о с а б б а б с а с с а т с а т с т с т л с б а с с б т с в)1ЭТ-Х,Х,Х,Х,Х,ХАХХХ Д. ХХ Д ХХХХ А Д Х Д х,х,х,х,х,х,ххМ)б(37) ° 1 М,М,М,М,бТ,М,МММ т ХМ5(Д в1 Х,Х,Х,М,М,М,МХМ Т ХХ Т ММММЯфТ~ я1 х,х,х,х,х,х,хММ т хМ т ММММ т Щ в1 М,Х,Х Х Х,Х ХХХ Т ХХ Т ХХХХ Т Т МУФТ~ Рис. 79. Скемя у«тяноьп«нин последоеятпвьности Д)(Л по Сэнт«ру (к): Х1ХтхвХеХвХо-првимер; Х Х вЂ” комплементярнян пира нуквеотидов (Худ): б - — нябор синтевнроввниык олнгонуквеотидов е ббТ (дидевокеитимндинмонофосфятом) ня Э -копие ДНК, комплементарной анализируемой матрице.
Дидезоксинуклеозид-5' грифосфаты являются близкими структурными аналогами природных субстратов ДНК- полимеразы и, несмотря на отсутствие 3'-гидроксигруппы, опознаются ферментом и матрицей и включаются в строящуюся полинуклеотидную цепь. Если такое включение произошло, то дальнейший рост цепи прекращается, так как присоединившийся дидезоксинуклеотидный фрагмент лишен 3'-гидроксигруппы, необходимой для присоединения следующего звена цепи. Таким образом, ддНТФ играют роль терминаторов репликации. Так как наряду с введенным в реакционную смесь ддНТФ в ней присутствует аналогичный природный субстрат, то термииация на каждом данном участке происходит в небольшом числе случаев и статистически, т.е. возникаег набор олигомеров или полимеров разной длины.
При этом если, например, в реакционную смесь был введен ддТТФ, то получаемый набор продуктов представлен фрагментами, имеющими на 3'-конце остаток ддТТФ, длины которых соответствуют порядковым номерам остатков дТМФ в синтезируемых продуктах, если вести отсчет. от 5'-конца праймера (рис. 79).
Эти порядковые номера находят, как и в методе Максама — Гилберта, после разделения полученной смеси фрагментов электрофорезом в полиакриламидном геле по положению соответствующих им полос на снятой с геля фотокопии. Полученные номера одновременно являются номерами остатков дАМФ исследуемой матрицы, отсчитываемыми от ее звена, взаимодействующего с 5 '-концом праймера. Аналогично, приготовляя такие же реакционные смеси, в которые вместо ддТТФ введены ддЦТФ, ддАТФ или ддГТФ, можно определить положение на матрице остатков дГМФ, дТМФ и дЦМФ, а следовательно, и полную последовательность нуклеотидов реплицированного участка матрицы. Таким способом может быть прочитана последовательность в несколько сотен нуклеотидов. После этого можно синтезировать олигонуклеатид, комплементарный 5'-концу секвенированной последовательности, и использовать его в качестве праймера для проведения следующего цикла секвенирования.
В исходном варианте для изложенного метода определения последовательности нувспеотидов использовали дезоксинуклеозид-5'-трифосфат, меченный радиоактивными изотопами втР или вгР в а-положении трифосфатной группы. Радиоактивная метка попадала в каждое звено сиитезируемой цепи, что обеспечивало высокую чувствительность метода. Й В настоящее время наметилась тенденция к переходу на менее чувствительный, но зато легко поддающийся автоматизации флуоресцентный метод. С этой целью либо к праймеру, либо к терминирующим ддНТФ присоединяют специальные красители, дающие при облучении лучом лазера интенсивную флуоресценцню.
В специальных приборах для аотполватикесково секвекироваиия по ходу злектрофореза в некоторой области геля проводится непрерывная регистрация интенсивности флуоресценции и ее спектральных характеристик. Таким образом, ход разделения фиксируется сразу во время электрофореэа. При этом для анализа распределения вдоль синтезируемой цепи ДНК каждого из четырех нуклеотидов используют четыре разных красителя, отличающихся спектрами флуоресценции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
