Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Таким образом, последовательность Т-пептидов и С-пептидов в исходной цепи имеет вид 7.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Аналогичные трипсину и химотрипсину ферменты, расщепляющие по моно- мерным остаткам определенного типа, существуют и для рибонуклеиновых кислот. К их числу относится рассмотренная ранее панкреатическая рибонуклеаза, или, как ее сокращенно называют, РНКаза А. Этот фермент специфично расщепляет РНК после остатков пиримидиновых нуклеотидов с образованием на первом этапе на образовавшемся новом 3'-конце отщепленного фрагмента 2',3'-циклоФасфатной группы, а на 5'-конце второго фрагмента — свободной 5'-гидрокси- группы ДВ ОВ О О ДВ НО~ О. О 0 О О Дв' + О 4~ ~ Р о— О О (КВ Я) где  — урацил или цитозин.
Известен и широко используется и более избирательный фермент Т1 РНКаза, вюторая катализирует аналогичное расщепление после остатков гуанозииа. Однако средний размер получаемых в обоих случаях фрагментов очень мал, а число Фрагментов, образующихся из больших молекул РНК, весьма велико. Даже если Т10 — Т4 — Т14 — Т2 — Т5 — ТЗ вЂ” Т1 — Т12 — Т6 — Т11 — Т7 — Т9 — Т8 — Т13 С5 — С7 — С9 — С10 — С1 — Сб — СЗ вЂ” С8 — С4 — С2 Приведенный пример является вполне <благополучными в там смысле, что нигде не возникает неоднозначностей в принятии решения по объединению пептидов. Нетрудно, однако, убедиться, что если бы, например, в серии С-пептидов оказалось два пептида, имеющих на Н-конце дипептид ЕИ, то осталось бы неясным, какой из них примыкает к С-концу пептида С-5.
Точно так же, что еще более вероятно, если бы в серии Т-пептидов имелось два (или более) пептида, начинающихся с остатка фенилаланина, то осталось бы неясным, какой пептид примыкает к С-концу пептида Т-10. Вероятность таких совпадений повышается с ростом размера белка, чему сопутствует рост числа пептидов, образующихся при трипсиновом, химотрипсиновом или каком-либо другом специфичном расщеплении.
Как уже говорилось, в этом случае приходится прибегать к большему числу вариантов специфического расщепления цепи. удается их разделить и определить их первичную структуру, как пРавило, не удается собрать из этих данных полную исходную структуру РНК да(ке в случае таких сравнительно небольших молекул, как транспортные РНК. Поэтому, хотя на этом пути с некоторыми дополнительными ухищрениями и были получены первые данные о структуре рибонуклеиновых кислот, прямое секвенированне РНК имеет ограниченное применение. Совершенно иначе обстоит дело с ДНК.
У многих бактерий найдены ферменты, которые гидролизуют двунитевую ДНК по участкам, обладающим строго определенной последовательностью из нескольких нуклеотидов, чаще всего четырех или шести. Такие фрагменты встречаются довольно редко — в среднем соответственно один на 256 для фрагментов из четырех нуклеотидов или один на 4048 для фрагментов из шести нуклеотидов, т.е. фрагменты в среднем имеют значительную длину, а число фрагментов со строго определенной последовательностью не очень велико. Расщепление обеих нитей происходит по участкам, которые для большинства ферментов згой группы построены из двух идентичных фрагментов или, кзк принято говорить, самокомплементариы.
Например, фермент из Е.со!!', называемый сокращенно ЕсоВ1, катализирует гидролиз по участкам, с последовательностью нуклеотидов С вЂ” А — А — Т вЂ” Т вЂ” С, причем расщепление в обеих цепях происходит между остатками 6 и А. Схема расщепления, таким образом, может быть записана в виде ! ( б (-РОРАРАРТРТРС вЂ” ( 3 ! ( б ! — РО-ОК РАРАртртрС вЂ” ( 3 ! (3(! — сртртрлрлрор"(б ! (3 ! — сртРТРАРАР Поор-(бз! Этн ферменты известны под общим названием эпдаиуклсазм респ(риииии, Термин эидоиуклеаэа означает, что фермент катэлизирует расщепление нуклеиново й кислоты по внутренним фосфодиэфирным связям в отличие от экзануклсаз, катализирующих отщепление концевых звеньев нуклеиновой кислоты 1к их числу относится упоминавшаяся в 3 7.3 фосфодиэстераза из змеиных ядов). Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рссп(рики(азал(и. В табл.
7. . 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы, С помощью рестриктаз удается расщепить болыпие молекулы ДНК на фрагменты умеренной длины, которые, как правило, могут быть разделены электрофорезом. Совпадение длин двух фрагментов, которое воспрепятствовало бы разделению, — событие маловероятное. В том случае, если все же это происходит, следует воспользоваться ферментом другой специфичности.
участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестриктазой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других ц це" лей, в частности для генной инженерии (см. 3 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют (Аизичесхил( карп(ироэаиися ДНК, а саму схему такого распределении — физической картой ДНК'. 'Термин <физический> здесь используется просто как альтернатива <биологическому» т.е.
Распределению в.молекуле ДНК участков, программируюших различные гены. 276 Последовательность 5'-+3' 3'-+5' Микроорганизм Сакра(пенне ССАТСС ССТА66 т СААТТС СТТААС РиССССРу РуССССРв 1, СССС СССС ССОС ССС6 Т 6ТРуРвАС САРнруТО 1 ААОСТТ ТТСОАА т ОТТААС СААТТС СС66 СССС СТССАС САССТС Вас111ва вву1о11((веЕасЕева И ВаайП ЕасЬегЕсЬЕа со11 ВТ13 ЕсоВХ НвеворЬ11вв аеЕурбЕвв Иае11 НаеворЬ31вв аеЕурбгив НаеШ НвеворЬ11ва Ьаево1угАсва НЬа1 НаеворЬ11ав АвЕТвевгае Йй НЕВН11 НаеворЬ11ав АвЕ1вевгае Вд И'в()Ш Нра1 ИаеворЬ11вв рагаАвЕТвевгае НаеворЬ11вв рагаАпЕ1вевгае ИраП Зсгербовусев а1Ъвв 6 ЯаЫ Т а б л и ц а 7.5.
Неяотирые ресзрюпи(ва и расякзшяемьзе имк ы(с(юзвя(ательзамяи (стрелками наказаны зичям раацеяяепия) Прорыв в секвенировании полинуклеотидов, в первую очередь ДНК, был совершен после того, как исследователи отказались от основных канонов аналитической химии и пошли по принципиально иному пути, позволившему задачу, длительное время казавшуюся невыполнимой, превратить в рутинную процедуру, Почти одновременно было предложено т С два метода, основанных на одной принц ципиальной идеологии, хотя резко т отличающихся по своему химическому т содержанию. Эти методы известны как жетод Маквала — Гилберта и .иетод т Сэвеера.
С Первый этап метода Максама — Гилберта состоит в том, что в 5 '-конец анализируемого полинуклеотида с Рис. 77. Ивевлизироввииая схема севвеии- помощью полинуклеотид киназы вводят роввния ДНК в геле и определенная поове- меченый остаток фосфорной кислоты максимально доступной удельной активности. В дальнейшем манипулируют со столь малыми количествами образца, что регистрации поддаются только его щюизводные, содержащие 5'-конец, т.е. высокорадиоактивный остаток фосфорной кислоты, а любые иные производные, если даже присутствуют, остаются немечеными и потому нетестированными (невидимыми).
На втором этапе гомогенный, меченный по 5 -концу полинуклеотид подвергается в четырех отдельных пробах химической обработке, приводящей к специфическому или, по крайней мере, преимущественному расщеплению по одному из четырех типов нуклеотидных остатков. Используемые химические реакции приведены ниже. Существенным моментом этого этапа является проведение каждой нз четырех реакций на такую глубину, что в среднем на каждую цепочку приходится один разрыв. Это нетрудно осуществить путем подбора времени реакции и концентраций используемых реагентов. В итоге в каждой из четырех проб <видимымиэ в только что упомянутом смысле этого слова остаются фрагменты исходного полинуклеотида, содержащие неповрежденный 5'-конец и обрезанные по всем мыслимым точкам, содержащим определенный тип нуклеотида.
На третьем этапе проводится электрофорез всех четырех проб в полиакриламидном геле. Для того чтобы условия разделения были идентичными во всех четырех пробах, пробы неяосят на один гель и разделяют на четырех пареллельных дорожках этого геля. Разделение, как уже говорилось в 2 7.1, проходит по длине, и положение каждого фрагмента, дегектируемое радиоавтографическн, данг.его длину, а тем самым и положение соетвегегвующего мономера в исходной цепи.
Таким образом, на одной дорожке, если речь идет о ДНК-фрагменте, определяется положение всех остатков тимидина, на другой — всех остатков дезоксицитидина, на третьей — всех остатков дезокснгуанозина и на четвертой — всех остатков дезоксиаденозина. В сумме это дает положение в исходном полинуклеотиде всех мономеров, а это и означает, что определяется его первичная структура.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
