Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 67
Текст из файла (страница 67)
Ри больших количествах исходного мате нала и содержании в нем по ежа атериала и достаточно высоком и в нем подлежащего определению антигена или антитела м ж пользоваться тем что об в ти а можно восто о разование комплекса антиген — антитело часто соп во дается его осаждением (п ип — асто сопровожкожно зарегист и вать о (преципитацией). В этом случае образование в ие комплекса р р ровать по помутнению раствора (турбидиметрически). Однако развитие иммуноанализа все более сме щаегся в область анализа малых количеств веществ, так что становится ч езвычайн определения. Это ос к в о Р но актуальной чувствительность метода д тигается введением специальных меток в о в тов, участвующ б к в один из компонених в о разовании спе ф цифического комплекса антиген — антител .
я этой цели широко использ ют — аититело. у т радиоактивные метки. Соответствующий нетод называют радиоилииуноанааизо.а. В п о.и. последние десятилетия наблюдается р д уноанализа нерадиохимическими методами е денция замены а иоимм Среди них наиболее ши дами детекции. ироко используется иататунафержентнмй анализ. Он б Руется на конъюга ии о ц диого из компонентов с определенным фв й анализ. н азиРый можно оп е м ч рментом, котоекв ез ределить с очень высокой чувствительность .
П ю. оследняя достигаетку фо результате образования ог омного чи лу фермента. О и р числа молекул продукта на каждую моледн и из широко используемых с этой целью фе менто 'к Рассмотренная в 3 7.3 пе окси аза. ью, ерментов являетко в . пероксидаза, Будучи конъюгирована с одним из команентов специфического кон ъюги к комплекса, она позволяет легко определ ить содержание вето ированного с ней компонента либо по ок о при дооавленни Н О о крашиванию продукта, возникаютккно т т и кисляемого органического субстрата бо сти хемилюминесценции в смеси Н 0 с , ли по интентакже щелочная ос атаза из тОт с люминолом.
Широко используется е щелочная фосфатаза из кишечника теленка. В качестве субст ага в э 'кучае используют 5-Нг-4-01-3-ин олил та г — -индолилфосфат, который при отщеплении фосфадает характерное окрашиванне. Существ ет нес кмм яв у несколько версий проведения имм но у анализа. аиоолее очевид- Н 6 акал является применение п ямого коли ализир емое ве Р чественного иммуноанализа при которо ом 99„ ал ру щество должно практически полност ью пере ти в комплекс. й 9„„„ 9,9919 9.НЕВ Метка при этом должна содержаться в том компоненте, который образует комп лекс с анализируемым веществом.
Например, для анализа определенного антиге на нужно располагать антителом, специфичным к этому антигену, ввести в него метку (радиоактивную, ферментную, люминесцентную и т.д.) и количественно перевести анализируемое вещество в комплекс. Для того чтобы достичь макси мального уровня этого перехода, меченое антитело нужно брать в избытке, Но тогда нужно предусмотреть процедуру отделения комплекса от избытка меченого антитела. Для этих целей используют иммобилизацию анализируемого компонента на твердой поверхности. В этом случае комплекс антиген — антитело остается на поверхности, тогда как избыток меченого антитела, не вошедший в состав комплекса, легко удаляется.
Широко распространенная версия иммуноанализа базируется на введении метки во вспомогательный белок, обладающий сродством к комплексу антиген— антитело. В этом случае детектируется трехкомпонентный комплекс антиген— антитело — меченый вспомогательный белок. Такой комплекс часто называют сэндаичеяь Одна из наиболее широко используемых систем такого рода основана на использовании витамина биотина.
Биотин описан в З 4.6, и его основная биологическая функция состоит в участии в качестве кофактора в ферментах, катализирующих реакции карбоксилирования, однако наряду с этим он обладает уникальным сродством к белку ааидину, содержащемуся в яичном желтке, и к его бактериапьному аналогу стрсптпааидину, Оба эти белка являются тетрамерамн, состоящими из четырех идентичных субъеднниц, каждая из которых обладает активным центром для связывания биотина. Биотин может быть легко введен в антитело путем реакции его карбоксильной группы с какой-либо аминогруппой антитела. Далее для определения комплекса антиген — антитело можно использовать авидин в качестве носителя чувствительной метки, например конъюгат авидина с пероксидазой.
При анализе содержания в образце антител определенной специфичности можно использовать так называемый белок А из стафилококка, который обладает специфичвским сродством к константной части антител в комплексе с их антигенами или гаптенами. Образование комплекса антиген — антитело регистрируется после удаления избытка антитела по взаимодействию конъюгата белка А с детектируеиой меткой, например пероксидазой. Для того чтобы продемонстрировать принцип иммуноферментного анализа, приведем результаты анализа иммуноглобулина, специфичного к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в сыворотке крови пациентов.
Этот показатель является очень важным как минимум по двум аспектам. Применительно к человеку, укушенному клещом, результат анализа показывает, достаточно ли устойчив человек к энцефалиту. А в случае использования крови здоровых доноров этот показатель свидетельствует о том, содержит ли кровь достаточное количество антивирусных антител, для того чтобы быть использованной для приготовления антивя русного иммуноглобулина. Последний может быть использован для введения человеку укушенному клещом, для предотвращения развития инфекции. Извес вест.
иКЭ, но, что поверхностный вирусный белок Е является основным антигеном ВК Этот белок можно достаточно прочно сорбировать на поверхности полистирол ьной пробирки. Если взять его в избытке, достаточном для количественного с связывания антител к белку Е в образце, последние будут сорбированы практичес чесва полностью.
После удаления образца добавляется конъюгат стафилококков ого 258 белка А с пероксидазой хрена, количество с которой определяется по окрашиванию, а вва возникающему при добавлении смеси 4- аминоантипирина и фенола. Этот анализ ж ~Р, $ % а является типичным примером использова- т ния конструкции сэндвича, которая в этом с яв случае состоит нз антигена, специфического антитела и вспомогательного белка А, а .аг несущего метку. Меченый компонент,, ~ т' о а о й.М предназначенный для иммунохимического анализа, можно также использовать в та та 30 00 с» конкурентном варианте.
В этом случае Рнг.. 7И Излггнгшн конц нтр»пнн ннометка вводится в определяемый антиген, гпобнн» н гыноротлг крови бочьного прн Меченый антиген добавляется к образцу и ннф»Р»тн инш»Рп» ('Ушггтсгнног ш»1~- ш»нно т(»шнн многчобнн» н»чнн»~ тгн ш- едова Ыьно, Разба Я Я немеченым ргзз 4 „,т н„.ч» п()»ступ»(к,нн„н, („ антигеном, присутствующим в этом образ- т~. Вторнчнын нрштуп ньнтын»гт понт~рце. Степень разбавления указывает на ног пош»шгннг уроьня миогчобнн» (крнколичество антнгена в образце. В качестве в»я й (по п»ннын В В Рашко г со»ь.) примера можно привести анализ миоглобина.
Этот белок находится в мышцах, включая и сердечную мышцу, и играет роль депо кислорода. Сердечная мышца повреждается во время инфаркта, и миоглобин попадаег в кровяное русло. Определение количества миоглобина в крови может служить указанием на инфаркт миокарда, а измерение этого количества через определенные промежутки времени позволяет следить за течением заболевания. Один из эффективных методов такого определения был разработан на основе миоглобина, меченного '001, путем обработки белка иодированным реагентом Болтон — Хантера 0 ~ Н,СН,— С(0) — 4) — Х !25г/ О 100 который ацилирует лизиновые г-аминогруппы белка.
Добавление к анализируемому образцу крови пациента приводило к разбавлению тем более сильному, чем больше было количество миоглобина в образце. По завершении образования комплекса миоглобина и его радиоактивного производного к пробе добавляли в вен ас енасыщающих количествах антитела к миоглобину, что приводило к осаждению пнш ншь части миоглобина, причем как нативного, так и меченого.
Очевидно, что чем ни больше миоглобина было в анализируемом образце, тем меньшая доля от всего его многлобина, а следовательно, и тем меньшее количество радиоактивного мате териала попадало в выпавший осадок. Определение радиоактивности осадка поэзо воляло с помощью заранее построенных калибровочных кривых определить соде д Ржание миоглобина в пробах и проследить за накоплением миоглобина у пацнен квента с предполагаемым инфарктом. На рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
