Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Поэта му необходимо использовать высокое давление для того, чтобы достигнуть хо шего ро разделения за короткое время, В последние десятилетия развивались специальные методы, основанные на применении высокого давления, позволяющего проводить элюцию за несколько минут, используя маленькие размеры частиц неподвижной фазы. этот метод называ4от высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ, или Нрьс, Н40Ь Ргеззаге 1лйвггб Сйгоиасобгар(4у). Приборы для ВЭЖХ (НР(.с-хроматографы) выпускаются многими фирмами и стали неотьемлемой аппаратурой в каждой биохимической лаборатории. Значительное число сорбентов разрабатывается в различных фирмах, и колонки, наполненные этими сорбентами, также поставляются соответствующими фирмами. Все НРЬС-приборы высокоавтоматизированы, что позволяет проводить непрерывную регистрацию разных физических характеристик злюируемого материала.
В табл. 7.1 приведены сорбенты и носители, наиболее 444ироко используемые в жидкостной хроматографии биополимеров. Прадо.икание табл. 7.1. )Уродолженне !над.ь 7,1 Полимерная основа и коммерческое название Природа функциональных групп Область применения ДЕАЕ-сефароза Диэтиламинозтильная -0 СзН41Н(СзНз)з Анионообмеинал хромато- граф ия Носитель для распредели- яВ порядке возрастания размера пор, т.е. область разделения молекулярных масс. Поянстврол тельной хроматографии с не полярными и полярными растворителями Катиоиообменная хроматография Аниоиообменная хромато- графия Сополимер стирала Вторым широко используемым в биохимии зональным методом разделения смесей является электрофорез.
В этом случае зоны создаются в результате того, что разные компоненты смеси с различной скоростью перемещаются з электрическом поле. Скорость перемещения о определяется основным уравнением Сульфокатионнты — С4Н4 — БО)Н Акнонтм С4НЗ вЂ” СНСНЗ и дивниня- бснзола СЬН4 ( — СН=СНЗ)З 'Фирменные названия: яауэксы, амбсрлиты и лр. (7.1) Лес = )о, Поянакрняамкям где Я вЂ” число единиц заряда у частицы; с — заряд электрона; я — напряженность приложенного электрического поля; Х вЂ” коэффициент вязкого трения частиц.
Последняя величина представляет собой отношение скорости перемещения частицы в вязкой среде к приложенной силе. Согласно уравнению Стокса для сферической частицы радиуса г, Сополимеризация зкркяамида Н)С=СНСО)ЧНз и (Ч, )Ч ' -месяясн-дис-акрилзмияа Для разделения по молеку Н~=СНСО)ЧНСНз)ЧНСОСН= СНз Карбокснмстияьиая — СНз — СОО -СОО)яа лярным массам и для обессо- лизання В!О-Ое! (от Р-4 до Р-300)* Акрил (ог Р-4 яо Р-3000) Биогсяь СМ-2 Вяззссу! СОзН (7.2) Хе = бяз)г, Катионообменная хроматография (устойчив к действию растворов кислот и щелочей до 1М концентрации) где 0 — вязкость среды, з которой проводится электрофорез. Радиус г сферической частицы с известной молекулярной массой и плотностью легко вычисляется, т.е.
величину уо, ожидаемую исходя из предположения о сферической форме, нетрудно рассчитать. Для частиц несферической формы )' больше, чем Уо, причем чем более вытянута частица, тем существеннее это отличие. В связи с этим значение у дает определенное представление о форме биополимера. Например, для глобулярных белков это отличие, как правило, невелико, а для двуспиральных нуклеиновых кислот весьма существенно, Метод применим как для разделения нуклеиновых кислот, являющихся полианионами и всегда перемещающихся в направлении катода, так и к белкам, которые при значениях рН, отличающихся от их изоэлектрической точки, несут положительный или отрицательный заряд и з соответствии с ним перемещаются в направлении одного из электродов.
Изменяя рН, можно изменять в широком диапазоне заряд белковых молекул, и поэтому белки, не разделяемые в электрофорезе при одних значениях рН, могут оказаться эффективно разделяемыми при других. Электрофорез в растворе пока имеет весьма ограниченное применение, поскольку разделяемые по ходу электрофореза зоны, во-первых, подвергаются дифФузионному размыванию, а во-вторых, что более существенно, размываются конвекционными токами, возникающими в результате незначительных неоднородностей температуры в системе, при ничтожных механических воздействиях и т.п.
В "астоящее время, по-видимому, начинаегся второе рождение этого метода в связи с воэможностью проведения электрофореза з условиях невесомости на орбиталь"ых космических станциях. Силаиольные группы Носитель для адсорбцнон- Золи кремниевой кислоты ной хроматографии 3140 Кизельгель 4000 (от 40 до 4000 А) Силоксановые группы :~1-0-61 с Лихросфер Я1 Лихросорб (Ы сЪгосогЪ) Лихропреп (ь(сйгоргер) Полигосил (Ро1уяоа11) Нуклсоснл (Кз)с1еоз11) Гидрофобиэированные снлнкагели Носитель для хроматографии с обращенными фазами СНз -Я-М-Я1 — Н сн Перисорб (Рег! зогЪ) Вид.
(Ууа .) де Н - огнл (Сз), октил (Сз), ктадецил (Сы) или феннл Основное практическое значение имеет электрофорез в гелях (сель-элентпрофо. рез). ). При использовании гелей практически исчезаег опасность конвекции, резко уменьшается коэффициент диффузии и размывание зон незначительно. В результате на одном геле длиной около метра можно получить до сотни или даже более зон, Наиболее широко используется элсктрофорез в сшитых полиакриламидных и агарозных гелях. Агароза является компонентом агар-агара, содержащегося в красных морских водорослях.
Она построена из чередующихся остатков 0-галек тазы и 3,6-ангидро-1 галактозы, связанных попеременно Н(1 — + 4)- и о(1 — е 3) связями: Гель возникает в результате образования водородных связей между цепями агарозы и в отличие от полиакриламида не содержит ковалентных межцепных сшивок. П и электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот в геле удается Р разделять фрагменты длиной в сотни нуклеотидов, различающиеся на одно звено. При этом действуют два фактора — удлинение полинуклеотида приводит одновременно к возрастанию заряда и к увеличению сопротивления среды его перемещению. Второй фактор пересиливает, и в связи с этим быстрее перемещаются более короткие полинуклеотидные фрагменты.
Примеры злектрофореграмм приведены на рис. 77 и 78. Зональное разделение можно также проводить с помощью седиментации биополимеров в центробежном поле в ультрацентрифугах". Величиной, характеризующей подвижность частиц в центробежном поле, является консепантпа седижентачии Я, представляющая собой отношение скорости перемещения седиментирующей частицы к величине центробежного ускорения ь~эг, где ы — угловая скорость вращения ротора ультрацентрифуги, г — расстояние частицы до оси ротора. Константа седиментации может быть экспериментально определена в специальных аналитических центрифугах, позволяющих фиксировать положение зоны, содержащей исследуемый биополимер, в произвольный момент времени непосредственно во вращающемся роторе и тем самым измерять скорость перемещения частиц. Константа седиментации выражается уравнением (7.
3) где и — масса частицысяе — плотность растворителя; р — так называемая плавучая плотность частицы, т.е. та плотность, которую она имеет, находясь в растворе (это величина, равная 1/суд, где е д — парциальный удельный объем); 7' — коэффициент вязкого трения. Если разделяемую смесь нанести в виде зоны поверх растворителя в центри- * См.
Кнорре ДГ., Кръсеоеа Л Ф., Муэмнантое В.С Физическая химия — Мэ Высшая школа, 1990. э 18.3. 242 фужной пробирке, то в ходе центрифугирования вещества, различающиеся по константам седиментации, будут формировать отдельные зоны. По окончании центрифугирования можно либо проколоть дно пробирки и по каплям разлить ~одержимое в ряд приемников так, чтобы образовавшиеся зоны попали в разные приемники, либо отсосать содержимое пробирки через опущенную до дна трубочку, опять-таки собирая серию фракций.
Чтобы не происходило перемешивания ~одержимого пробирки при раскручивании ротора и при его остановке, используют специальные роторы (так называемые бакет-роторы от англ. ЬасХес — ведро), э которых пробирки подвешены на пеарнирах и разворачиваются по направлению поля от вертикального в начальный момент времени (направление поля силы тяжести) до практически горизонтального при полном наборе скорости и в обратном направлении при остановке ротора. Чаще всего разделяемую смесь наносят на раствор сахаровы, который приготовлен таким образом, что уже в верхнем слое его плотность выше, чем плотность наносимого образца (иначе произошло бы практически мгновенное перемешиваяие), и постепенно возрастает в направлении к дну пробирки.
Наличие градиента концентрации сахаровы существенно ослабляет диффузионное размывание зои, так как если по ходу перемещения зоны какого-либо биополимера часть его в Результате диффузии опережает движение основной зоны, то она попадает в область с более высокой плотностью растворителя ес и в соответствии с (7.3) их перемещение затормаживается, а в случае их диффузии в сторону отверстия пробирки по той же причине их движение ускоряется.
В обоих случаях частицы, ушедшие из <своей> зоны в результате диффузии, отбрасываются обратно. Поскольку при наличии аналитической ультрацентрифуги константы седиментацни легко определяются путем фотографирования границы седиментации исследуемого биополимера при нескольких различных временах от начала седиментацни, то константы седиментации часто используют как физико-химические характеристики биополимеров и их комплексов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
