Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Сорбент, несущий положительно заряженные группы, называют антионитом В качестве ионитов чаще всего используют материалы на гидрофильной основе — целлюлозе, декстране, силнкагеле илн пористых стеклах. Эти материалы превращаются в производные, несущие положительно заряженные анионообменные группы или отрицательно заряженные катионообмеиные группы. Так, на основе целлюлозы путем соответствующих химических обработок получают диэтнламнноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу) и фосфоцеллюлозу, функциональные группы которых связаны через гидроксигруппы с остатками глюкозы: — «Оис(! 61 — ссОСс(! б! — «Осе(! 6!в 1 нэ НОНС , нг О ! — «Осе (1 61 — «ОЬс(1 61 — «ОСс(! 6 !— Ояат«е т с««тото у ас~ма сееаяемса Используется также синтетический полимер — полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками: — СНу-СН вЂ” СН вЂ” СН вЂ” СН— ! ! СО СО нн ны сн нн, ныл ! СО СО ! -Сн(-С н — Сну-СН вЂ” СН- Ояатмемт сммтото у ос~ма пол а Л ла мяа Сшнвки в этом случае возникают в результате добавления метиленбисакриламида в реакционную смесь, в которой проходит цепная свободнорадиквльная полимеризация акриламида.
Размер пор образующихся молекулярных сит регулируется при их получении количеством добавляемого сшивающего реагента. Вода, находящаяся в порах гранул молекулярного сита, образует неподвижную фазу, н в эти поры могут диффундировать частицы, имеющие не слишком большой размер. Для больших молекул эти поры недоступны и они проходят через колонку, заполненную гранулами молекулярного сита (геля), не задерживав% и поэтому существенно опережая низкомолекулярные компоненты.
Такой процесс разделения называют аелъ-фильтрацией. Во многих из перечисленных методов разделения применяются в значительных количествах различные вспомогательные низкомолекулярные вещества— органические растворители, соли и кислоты, создающие нужные значения ионной силы и РН. Перед окончательным выделением очищенного биополимера или перед тем как подвергать частично очищенный материал следующей стадии фракционирования, обычно требуется избавиться от этих вспомогательных соединений. Для этой цели широко используется процедура, называемая диалиэои.
Она основана на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для бнополимеров. Чаще всего с этой целью использу ют мембраны (пленки) из целлофана, который представляет собой нитрат целлкт лозы с содержанием остатков нитрата порядка одного моля на моль остатков глюкозы. Такой материал обладает необходимой механической прочностью и в то же время достаточно гидрофилен, чтобы через него проходили молекулы воды н гидрофильных низкомолекулярных компонентов. В то же время для полимерных 236 „олекул, в том числе для белков и нуклеиновых кислот, целлофан непроницаем. лабораторном варианте подлежащий диааизу раствор биополимера помещают в мешок из целлофана и погружают последний в сосуд с водой.
Многократная сна воды или, еще лучше, непрерывный поток воды через этот сосуд приводят ~мена воды или, к полному переходу в него всех проходящих через целлофан компон ентов а бнополимеры с ы остаются внутри целлофанового мешка. На этом же принципе основ ль афильтраиия, при которой через проницаемую для низкомолекулярных вана ульрафилът о ложке, веществ мем ран, мбрану, закрепленную на пористой механически прочной и д и пускают под давлением подлежащий очистке раствор. Все описанные выше методы грубого фракционирования, широко используемые на начальных этапах выделения биополимеров из биомассы, чаще всего не приводят к желаемому конечному результату, т.е. к получению индивидуального вещества.
Последнее, как правило, достигается при использовании группы методов, которы е можно квалифицировать как завальные .иетодм разделения. Общая идеология этих методов состоит в том, что создается некоторая система, в котой компоненты смеси перемещаются с различными скоростями.
Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся в разными скоростями, будут формировать отдельные зоны, которые в конце процедуры разделения можно механически взнести в различные приемники, т.е. получить целую серию фракций. Р Следует отметить, что скорость перемещения каждого компонента в ред оп еленной системе разделения и при заданных внешних условиях является его физико-химической константой и может быть использована для идентификации вещества или регистрации его присутствия в некоторой системе.
Поэтому зональные методы наряду с нх огромным препаративным значением имеют и важное аналитическое применение. Важнейшим зональным методом является хроматография*.Как известно, хроматография бывает газовой, газожидкостной и жидкостной. По очевидным причинам при разделении биополимеров н их анализе используется только жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ в помощью тока злюирующей жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам.
При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе, пр ичем тем большую, чем выше его сродство к этой фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона, содержащая выделяемое или анализируемое вещество, относительно неподвижной фазы. В зависимости от природы физико-химического явления, лежащего в основе Распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами, различают адсорбционную, ионообменную, распределительную и гель-хроматографию.
Последнюю также называют эксклюзионной хроматографией. В адсор ц а со б ионной хроматографии в качестве неподвижной фазы наиболее широко используют окснд алюминия. В ионообменной хроматографии используются те же типы ионитов, что и в ионообменной сорбции. См. Кнорре ДГ., Крассова Л.сп., Музыка»тоо В.С. Физическая химия.— Мл Высшая шкОла 1990 6 18 4 Продкавенве гввбя. 7.1. Область применения Природа функциональных групп Полимерная основа и коммерческое название Катионообменная хромато- Фосфоцеллюлоэа р-целлюлоэа -О-Рог графия Сульфоэтильная 0 СгН4 ооз Диэтиламнноэтильная -0-СгНЛН(огнь)г Анионообменная хромвто- дЕАЕ-целлюлоза графи я То же Аминоэтильная О ~гн4онг Триэтиламиноэтильнзя О СгН4 ~(сгнг)з АЕ целлюлоза ТЕАЕ-целлюлоза Другие полимерные пояисвхвриды (от С-10 до С-200)* Разделение по молекулярным массам Декстраны, сшитые мостиками -0-СНг-СН(ОН)СНг-0- с помощью энихлоргидринв Сульфопропильная Брчефадекс Сочетание иоиообменной хроматографии с молекуляр- но титовым действием 0 (СНг)з Боз 0АЕ~ефадекс Триэтиламиногтильная ч)-С,Н,-Й-(с,н,), Т а б л и ц а 7.1.
Сорбенты и носители, используемые в эсидКОСтНОй хреиатОГР44Рнн биопояимеров для фракциони13ования очень крупных молекул, высокополимерных ДНК вплоть до вирусов Носитель для аффинной хроматографии Поперечно сшитый полисахарид на основе нейтрального компонента агара Полимерная основа и Природа 06 р коммерческое название ~ функциональных групп Сшивка -Снг Сн(он)снг-О-Снг образуется в результате взаимодействия с 2,3-дибромпроланолом Карбоксиметильная -О-СН -СОО Карбоксиметильиая "О-Сн -СОО СМ-целлюлоза СМ-сефарозв Носитель для распределительной хроматографии Катионообменная хромато- графия Распределительная хро.ватография Основана На раСпредЕЛЕНиИ ВЕЩЕста Мвжд д умя несмешивающимися жидкими фазами.
При разделении биополимеров в У используют водно-органические фазы. Неподвижная жидкая фаза формируется в результате ее закрепления на пористом нерастворимом носителе силами полино. лекулярной адсорбции. Если носитель по своей природе гидрофилен (целлюлоза, силикагель, стекло), то неподвижной является более гидрофильная жидкая фаза, Если же полимер, например силикагель, модифицирован обьемистыми гид офоб р чфо ными радикалами, то неподвижной является более гидрофобная фаза. В зтои случае разделение называют сролатографией с обращенной фазой.
В гель-гро иатографии используют те же типы материалов, что и в гель-фи -фильтрации, но подбирают гели с таким диапазоном размеров пор, чтобы часть из них была доступна для разделяемых компонентов. Вследствие неоднородности пор чем больше по размерам разделяемые молекулы, тем меньшее число пор до ступно для этих молекул и соответственно тем меньшую долю времени они будут проводить в неподвижной фазе. Следовательно, зоны, отвечающие молекулам большего размера, будут перемещаться с более высокими скоростями.
Следует напомнить, что чем ближе к равновесному распределение компонентов между подвижной и неподвижной фазами, тем более эффективно разделение. В ремя, необходимое для достижения равновесного распределения, тем меньше чем меньше размеры частиц. Однако с уменьшением размера частиц сорбента сопротивление заполненной колонки потоку злюента становится сильнее.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
