Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Так, сродство лактатдегидрогеназы к такому сорбенту может быть повыше у шено присутствием в элюенте пирувата — второго субстрата фермента. Этот фермент катализирует реакцию Н40' + СНзСНОНСОО 540 Н + СНаС!О)СОО + Н' лактат пнруват Рнсутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммоби- лнзованным коф ментом, фер, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этом сор- зту по сравнению с другими Н40-зависнмымн ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией.
Иммобилиза ия н ц уклеиновых кислот и олигонуклеотидов позволяет пол чить 'оРбенты, способные с яет получить обла аю селективно связывать определенные нуклеинов с ые кислоты, еРодством адающие комплементарными последовательностя, бе ми, или лки, обладающие че, яством к нуклеиновым кислотам — к молекуле цели бо ком ли ее части. Наприр ро используется для извлечения эукариотических Р, олиго !дТ)-сефароза ши ко и )К иэ смеси нуклеиновых кислот, так как они имеют поли(А)хвосты на юз с -конце полннуклеотндной ели. По ц .
осле образования комплементарных комплек- ети св с нммобилизованным олиго(дТ) и от ел ! ) отделения всех других компонентов смеси ю к мРНК могут быть легко э чкн люнрованы после повышения температуры в плавления соответствующего дуплекса. ыше лидах и ну" елковых ки При дн нне лнгандов к носи ю обычно называют иясиобияиэациеи'. Можно использовать иммобилизацню субстратов для вы е ыделення соответствуюнх ферментов илн групп ферментов.
В случае субстратов с низкой молекулярной массой, для того чтобы исключить стернческие ломе помехи носителя, вводятся епейсерные фрагменты между носителем и субстратом. Т м, ак, для того чтобы выдедить ферменты, обладающие сродством к остатку АМР различных коферментов, могут быть использованы производные следующей стр структуры: еров, так и при проведении разнообКа п и вы еленин н очистке биапалимеров, Как пр д има количественное определение содержания биопо- разных исследований необходимо количественное емам об азце.
Во введе- нии к этой главе уже указывалось, чта иохим ют высо- ка к п авила, с очень не льшнм ба м количеством материала и поэтому гребу то ав етекции. Наиболее широко распространенные методы качувствительных ме дав д~~~~. елее на изм енин оптического поглощения спек дегекции основаны на ер ) образцов (люминес- радиоа адиоактивнасти (радиохимические д ) мета ы) или свечения центные методы). лучаях когда детектнСпекязрофото иеозрические же о р ш дм п именнмы в тех слу в ви имой или ха акте ным спектром поглощения в видимо руемые вещества обладают хара р симумы поглотр Ф ль а налетовой области.
та л. . В абл. 7.2 приведены характерные максим зх кислот (максимальные поглощения щения для компонентов нуклеиновых кислот ( ред- ДНК и РНК близки), для аминокислот, поглащ т, поглощающих в с для компонентов и навшихся в тексте низкомолекуляр- не й УФ-абл сти спектра и некоторых упоминавшихся в текс . П иве енные значения малярных экстинкци дл й я аминокислот ных соединений. Приведенны величин малярных экстннкпий и нуклеатндав да р ав ают п едставление а порядке величин молярны в составе биополимерав в нз биапалимеров, паек у кольк эти значения варьируют в состав ф ического метода ддэ е елах.
П и применении спектрофотомстр очень широких пределах, р е ет иметь в виду, что в дегекции биополимеров по х ду фр о хо ф акционирования следует им ют различные ных аства ах практически всегда присутствуют разл используемых водных раствор тельные электролитЫ, низкомалекулярные соединен , р ния, в пе вую очередь вспомогательны .
Эти соедияевнп ых значений рН и ионной силы. ти с вводимые для создания нужных р ля етекшзп быть и озрачны в о ласти б асти поглощения, используемой для д он ен ация вспомогательных веществ вы еляемых биополимеров, тем более что концентрация в выделяемых о я ков п евышает концентрацию биополимеров. з емай лине волны отсутствует, зп количество ан о анализируемого вещества находят по формуле (7,5) и = АУ/(51), ос У вЂ” объем измеряемой пробы; 5 г е А — измеренная оптическая плотность; з кюве и; 1 — лина пути светового пучка через кю малярный коэффициент экстинкции; — дли ек а в которой поглощает квжд пз Если измерения проводятся в области спектра, 248 Важной группой аффинных сор бентон являются иммобилизованные антитела, сорбенты могут быть использованы для специф«- или антнгены. В первом случае сор нты ческога выделения определенны х антигенов или гаптенов, из сложных смесей, В ют ижжуносорбеиозажи.
Во втором случае иммоэтом случае эти сорбенты называют ижжу бс ют выделению антител с определенной специ билизованные антигены спасо твуют в фичностью из сложной смеси антител. то аффинные методы разделения в ряде В заключение следует отметить, что а бал эффективными для решения задач, в принпипе доссл чаев оказываются ее э у поскольку позволяют уменьшить число стадий, а туп ных традиционным методам, поскольку п еление необходимого компонента в одну став отдельных случаях провести выделение н дию. 7.3.
МЕТОПЫ ДЕТЕКЦИИ БИОПОЛИМЕ Таблица72 М ~ максюзумзх поглощен нуклеиновых кислот аминокислот псптнднон связи и некоторых друтнх ниэкомолекулярвых соединений и чувствительность кх спектробнзгомегрнчесного оззределсзпзя Количество вещества, моль, соот- ветствующее оптической плот- ности 0,1 в кювете объемом Название соединения Лазз, нм Малярная экстнн кция при рН 7 н 25 С,м' см' 1 смз 1,о,з Адсноэин-5-монофосфат Гуаноэин-5-монофосфат Цитидин-5-монофосфат Уридхн-5-монофосфат Тимиднн-5-монофосфаг Триптофзл Тирозин НАР' МАРН Хлорофилл о Хлорофилл Ь 259 252 272 261 267 280 275 259 340 660 660 15,4 !Оз 13,7 10з 9,0.
10з !0,0. 10з 9 6.10з 6,0 10з 14.10з 18,0 10з 6 22.10з 7,4'104 — 9,1. 104 4,7 104 — 5,1 104 6,49.10 з 7 20.!О-з 1,1 ° 10 з 1,0 10з 1,04 10 з 1,6 104 7,1 10з 55 10з 1,6 10з 1,19 Пнз 1,95.10 з 6,49. 10'г 7 20.10чг 1,1.10 1' 1,О. 10'1 1,04 10 и 1,6 10п 7,1 ° 10 и 5,5 10 зг 1,6.10 зг 1,19.10 !г ! 95.10чг непомерное звено бнополимера, та для многих целей удобно расчет вести не на моль биополнме а, а на м р оль маномерных звеньев. Эта относится к спектрафотоиегрическаму определению нуклеиновых кислот в аб ласти нм, в которой 260 поглощает каждый гетерацикл, и к определению белков в области 200 нм, в -а ласти у белков которой поглощает каждая пептндная связь. В средней УФ-аб поглощение происходит в первую очередь за счет остатков триптафана и в меньшей мере за счет остатков тирозина, число которых в составе полимерной молекулы невелико и резко варьирует от белка к белку.
Поэтому при использовании этой области для спектрофотометрнческой детекцин белков целесообразно пользоваться моля ными вели вин т р чинами для бнополимера в целом. Максимум по у глощесоотношен не у три фансодержащих белков находится вблизи 280 нм. П нм. оэтому иногда тношение поглощения фракции при 260 и 280 нм используют для того, чтобы Женить, какая г ппа бион Ру олнмерав — белки нли нуклеинавые кислоты — преобладает ва фракции.
(75), с еств Чувствительность спектрафатомегрическога метода как ви дно из формулы пг геом ически сит от молярнои экстинкцни анализигз ани ируемого вещества н геометрических параметров кюветы. Современные спектрафотометры позволяют с удовлетворительной степенью точности регистрировать оптические плотнас- 1 гн порядка 0 1. Поэтом на \ у серийных приборах с кюветами емкостью порядка смз и иной порядка 1 4 дл пути светового пучка 1 с!н для веществ с малярной экстинкцие й ндка р34М ' см' мажет быть детектнравано 10 з моль вещества. Для нуклео— "дов н нуклеотидных фрагментов в составе нуклеиновых кислот, имеющих моленунлрную массу в пределах 300-400, это означает возможность дегектиравать зсколька микрограммов нуклеатиднога материала.
На микроспектрофотаметрах 249 О ) +Со,+йСНО+ЗИ,О Сяу. 1! ОН О О 1 +ЗЗЗЗ, СИНСООЗЗ 2 1 О + О Эта реакция Ро Р ши ко п именяется в анап изе аминокислотного состава белков, о аминокислот путем кипячения Для этой цели белки подвергают расщеплению до амино й об аботке повреждаются триптофан и амиды в течение 20 ч с 6 н. НС1. При твко ра ги из тся до МНз и свободных кислот. Далее дикарбоновых кислот, которые гидролизую аз еление, причем для выявления эов, проводят их хроматографическое раздел аминокислоты, хроматограмму пр р ок ашнвают нннгидрином. содержащих ами иальных приборах — алииоиислозпимя аиаяао ах В этом случае полученный гидролизат наносят на хроузатогра ическ колонку и затем элюируют по стандартно програм й выходяще. я в состав белков. Перед регистрацие в вие всех аминокислот, входящих в е з специаль- го элюата к нему примешивают н др инги ин и смесь пропускают через об ави ения ч з который н температура подо р вый термостат, время прохождения чере .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
