Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Возможность вырезания из ДНК определенных генов, получения их путем обратной транскрипции матричных РНК и разработка методов искусственного химикоферментативного синтеза генов позволили манипулировать генами, в том числе вставлять их в плазмиды или вирусы, а затем вносить их в микроорганизмы для последующего размножения.
Микробиологические методы позволили разработать методы селекции тех популяций микроорганизмов (клонов), которые выросли нз отдельных клеток, несущих желаемые признаки, например способных продуцировать определенные белки, не свойственные этим организмам. Так родилась генная инженерия, которая не только открыла новые горизонты в биотехнологии, но и стала важнейшим инструментом биохимических исследований, Наконец, селекция ДНК или РНК из искусственно созданной смеси огромного числа различных молекул нуклеиновых кислот с последующим размножением отобранных ДНК путем амплификации открыла путь к созданию нуклеиновых кислот с самыми разнообразными заданными свойствами. Все эти новые подходы также будут описаны в соответствующих параграфах этой главы.
При рассмотрении классических методов основной акцент делается на те нз них, которые находят существенно меньшее применение при изучении объектов неживой природы н низкомолекулярных соединений. Методы, широко используемые фундаментальными химическими дисциплинами и поэтому подробно разбираемые в соответствующих химических курсах, упоминаются лишь вкратце с акцентом на специфику их использования применительно к живым объектам. Основное же внимание в этой главе уделено специальным методам, порожденным самим развитием биохимии и тем модификациям физических методов исследова- 232 ст ктуры которые сделали возможным применять самые могучие инструы яня структуры, менты структурно хим й химии, такие, как рентгеноструктурный анализ и двумерная ЯМР-спектроскопия, я, к сложнейшим биохимическим объектам, каковыми являют-' ся белки и нуклеиновые кислоты.
7З. ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БИОПОЛИМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ФИЗИЧЕСКОЙ И АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ зделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты Все методы ра в результате как их-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Наиболее производительные процедуры р разделения основаны на различном распределении веществ между двумя фазами.
Любви такая процедура приводит к разделению исходной смеси на две части (фракции), в одну из которых преимущественно или полностью переходит выд ля деляемый компонент. Ввиду исключительной сложности смесей, с которыми имеют дело биохимики, на первых этапах разделения в подавляющем большинстве случаев фракция, содержащая выделяемое вещество, содержит множество других их компонентов, т.е. происходит лишь частичная очистка (обогащение смеси искомым компонентом). Выделение индивидуальных биополимеров является поэтому многоступенчатым процессом.
На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом, чем на предыдущей ступени, н содержащая меныпее число побочных компонентов. Такой процесс часто называют фраяЧнонирооание и. На каждой стадии разделения, включая и начальную, биополимер находится либо в виде раствора, либо в виде осадка. Говоря о разделении биополимеров, можно сразу же исключить из рассмотрения все методы, при которых одна из фаз, между которыми происходит распределение, является газовой. Биополимеры в ощутимых количествах в газовой фазе не существуют, Дня выделения искомого биополимера из раствора можно воспользоваться осаждением, для чего необходимо понизить растворимость этого биополнмера. Растворимость биополимеров в воде в значительной мере определяется их способностью к гндратацни.
У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратацни обеспечивается предпочтительным расположением на их поверхности гидрофильных групп. У нуклеиновых кислот важным фактором, способствующим гидратацни, является наличие в нейтральной и щелочной среде отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты. добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению гидроФильных биополнмеров. Так, для осаждения белков используется добавление к вх водным растворам ацетона. Нуклеиновые кислоты осаждаются добавлением этанола Роль электрического заряда в обеспечении растворимости биополимеров не "счерпывается формированием гндратных оболочек. Электростатическое отсевки~~вне между ионными атмосферами, образуемыми противоионами, препятствует сближению этих молекул до критического расстояния, на котором это оттапкнвауравновешивается силами ван-дер-ваальсова притяжения и я и становится воз- гзз можным слипанне частиц.
Нейтрализация заряда полимера обычно приводит к выпадению его в осадок. Нуклеиновые кислоты осаждаются из раствора при добавлении сильных кислот, например хлорной, и при добавлении солей многозарядных ионов, например лантанидов. С этим же связано действие ионной силы на растворимость белков — высокая концентрация соли приводит к сжатию ион ной атмосферы, образуемой противоионами, что ослабляет электростатическое отталкивание и облегчает сближение молекул полимера до критического расстояния, на котором ван-дер-ваальсово притяжение пересиливает кулоновское отталкивание и полимер выпадает в осадок. При этом концентрация соли, необходимая для осаждения, различна для разных белков, т.е.
при определенной ее концентрации из сложной смеси выпадает в осадок лишь определенная группа белков. Остальные остаются в растворе и могут быть высажены последующим повышением концентрации осадителя. Наиболее широко используется с этой целью осаждение сульфатом аммония. Популярность в этой роли именно сульфата аммония связана, во — первых, с его очень высокой растворимостью, а кроме того, с тем что, согласно многочисленным экспериментальным данным, даже высокие концентрации этой соли не оказывают заметного повреждающего (денатурирующего) действия на белки. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глугамата, имеющими при нейтральном и щелочных значениях рН отрицательный заряд, и остатками лизина и аргинина, имеющими при слабоосновных и тем более при нейтральном и кислых рН положительный заряд.
По мере повышения рН заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке (см, 3' 3.1) оказывается равным нулю. Вблизи этой области белок оказывается лишенным ионной атмосферы и его молекулы могут беспрепятственно сближаться до радиуса действия ван-дер-ваальсова притяжения. В ряде случаев это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения белков нз раствора называют иэоэлехтрически.и осаждение и.
Выпавший осадок биополимера можно отделить от раствора фильтрованием. Известно, что фильтрование является высокопроизводительной операцией, применяющейся даже в промышленных масштабах. В то же время часто из-за мелкого размера выпавших частиц фильтрование проходит очень медленно, что затягивает процедуру выделения и может служить источником нежелательной инактивации биополимера. Поэтому в тех случаях, когда это не противопоказано масштабами разделения, в биохимии предпочитают использовать центрифуги. Широко используются рефрижераторные центрифуги с охлаждением камеры, в которой вращается ротор.
Частицы осажденного вещества под действием центробежного поля оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (иадосадочная жидаосшь, или суаернашаига) легко сливается или отсасываегся. Скоростные центрифуги (ультраченглрифу~и), создающие центробежное ускорение порядка 10э ускорений силы тяжести, т.е, порядка 10 м.с, позволяют осаждать даже некоторые достаточно крупные индивидуаль10б ..2 алые надмолекулярные агрегаты, такие, как рибосомы и вирусы. На начальных стадиях выделения биополимеров из растворов, осадков, а в ряде случаев и из исходной биомассы нередко используют экстракцию. Например, для выделения из биологического материала суммарной фракции липидов применяют экстракцию серным эфиром.
Для очистки нуклеиновых кислот от основной массы белков и других биополимеров широко используется фенольная 234 -З01с(~ С) — ЗбЬс[~ — ь) — Эбсс(~ — ь)— 1 0 у,н, сн сн;мн г г Сг"э — уИс(1 4) — рбсс Н 4 1 — рЯс(1 4 )— ) 0 э- сбз эра~ ен ьасаоцеолчпюзы ера~мент яэяэгчелажвьзж Наконец, разделение может проводиться по размеру частиц с использованием сигового эффекта.
Молекулярные сита представляют собой материалы с порами евределенного размера или с порами, размер которых находится в некотором определенном не очень широком диапазоне. Вещества, молекулы которых по размеру меньше, чем размеры пор молекулярного сита, при пропускании через колонку с таким ситом задерживаются на некоторое время в этих порах и движУгся медленнее, чем большие молекулы, которые обтекают частички сита и выходят в свободном объеме раствора. В качестве молекулярных сит в биохимии "анболее широкое применение нашли так называемые сефадексы, представляющие собой полисахарнд декстран, обработанный эпихлоргидрином, в результате "его слабо разветвленные цепи декстрана оказываются соединены (сшиты) трехуглеродными мостиками; экстракция — обработка материала смесью вода — фенол.
Нуклеиновые кислоты нри этом переходят в водную фазу, т.е. в насыщенный раствор фенола в воде, а белки в основной массе денатурируют и располагаются на границе раздела водной и фенольной фаз — в интерфазе. Многие задачи по разделению веществ решаются с помощью сорбции части компонентов смеси на тех или иных сорбентах. В биохимии для этой цели часто нспользуют гель фосфата кальция, известный также под названием гидроксиапатнт, Для освобождения от низкомолекулярных соединений, содержащих ароматические кольца, применяют адсорбцню на активированном угле. Такие соединения взаимодействуют по механизму стекинга с полиароматической системой графита, составляющего основу активированного угля.
Заряженные компоненты можно сорбировать на ионитах — сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды в основном скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорбции иа ионитах происходит обмен этих противоионов на сорбируемые одноименно заряженные компоненты разделяемой смеси, в связи с чем такую сорбцию часто называют ионообменной. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и его называют катионитом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
