Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Зте представление, качественно не подвергающееся сомкшшю, оказалось недостаточным, когда началось систематическое количественное рассмотрение вопроса о специфичности ферментов. Эта проблема особенно остро встасг в снтуш!цях, когда в завом организме присутствует несколько схожих но структуре субстратов. Впервые эта проблема возникла при рассмотрении вопроса о спсцнфнчпост~ реакций, каталнзируемых амнноацил-тРНК-спнтетазами (см. Т 4.6). Все траэснортпые !э!1К имеют сходную пространственную структуру, и в ряде случаев амннаацнл-т!'1! К-синтетаза может катализировать, хотя и с очень небольшой скоростью, ацнэнйэованне соответствующей ей аминокислотой пе соответствуюц!ую сй т!'!! К, т.е.
происходит ошибочное амнпоацнлнрованне тр11К. 16азалось бы, дискриминация разных тРНК должна происходить на стадии узнавания, т,е, па стадии образования комплекса фермент — тРНК. Однако оказалось, что прн специфичном и неспецпфнчном амнноацнлнрованин для разных тр!1К отличаются не константы Мцхаэлнса, характеризующие стадию узнавания, а главным образом максимальные скорости процесса, т.е. кинетические константы процесса. В качестве еще одного примеР» можно привести фермент урацнл-ДИК-глпкознлазу, (см.
З 5.1). Этот фермент катализнрует выщепление остатка ураццла пз ДНК. Следовательно, ферменг должен четко днскримнннровать остатки дТМФ и дУМФ в составе ДНК Каза лось бы, фермент должен узнавать тс Д!!К, в которых присутствует урашш. Однако исследования, проведенные с ферме1пом нз плаценты человека, показали что сродство дуплекса, состоящего нз р(05)ы и р(ЙТ)ы, измеряется константой диссоциация 6,5 ° 10'" М, а в том случае, если во втором партнере вставлен одна остаток рббр(с(Т)г!х)бр(с(Т)г, сродство изменяется всего ка порядок, составля~ 7 10 а М. Узнавание поврежденного участка оказывается недостаточным д ля высокоизбирательного выщеплгния урацнла.
Эти и РЯд дРУгшвпРнмеРов заставлшот кРед~оло;кнтгь что за актом Узн""з ния, но перед каталитцческцм актом происходит некоторая более тошсая вз занм ная подстройка субстрата с активным центром. Ннымн словалш, ферментаткв ,явный и коипроцесс в таких случаях состоит нз трех;ланов: узнавания с образованием ческнх олекса фермент-субстрат, тонкой подстройки субстрата к набору каталцткче ляется спчпп ч самого акта катализа ! !стегано заметить, что такая подстройка явл" событием динамическим и выявление механизма этого процесса требует использования методов молекулярной динамики, о которых будет сказано в з 7.15, Второе явление, происходящее на уровне единичного фермента, состоит в изменении по ходу функционирования фермента на определенных этапах типа его активности.
Это, естественно, присуще тем ферментам, которые потенциально обладают несколькими разнотнпными активностями. Очень интересным и важным в практическом отношении является обратная транскринтазв, огромный интерес к которой связан с тем, что она входит в состав вируса ВИЧ-1, вызывающего СПИД.
Рассмотрим схематично механизм работы этого фермента, Вирус ВИЧ в составе зрелой внеклеточной частицы содержит геномную молекулу РЙК. Однако развитие вирусной инфекции связано с этой РНК лишь в самой начальной фазе. По информации, содержащейся в этой РНК, воснроизводится молекула ДНК, сначала однонитевая.
Затем на ней, как на матрице, воспроизводится комплементарная цепь и образующаяся двуннтевая ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Именно эта ДНК далее управляет синтезом копий мРНК, необходимых для программирования синтеза вирусных белков, и самой РНК вириона, которая должна входить в состав новых вирусных частиц. Исходная же РНК при синтезе ДНК постепенно уничтожается с помощью активности, известной под названием РНКвзы Н.
Этот фермент каталнзирует гндролитическое расщепление РНК в составе гибридного дуплекса РНК ДНК. Таким образом, для формирования двунитевой ДНК копии геномной РНК вируса ВИЧ-1 необходимо проявление трех активностей: обратной транскрипции для синтеза однонитевой ДНК, ДНК-полцмеразной активности для получения двунитевой ДНК и, наконец, активности РНКаэы Н. Оказывается, все эти активности присущи самой обратной транскриптазе вируса ВЙЧ-1. Однако самое удивительное состоит в том, что переключение активностей происходит строго упорядоченно, это не просто три параллельно работающих активных центра на одном ферменте. Последовательность происходящих событий представлена на рис.
68. Рассмотрим ее более подробно. Как всякая ДНК-полимераза, обратная транскриптаза может осуществлять лишь реакцию элонгации; для включения ее в работу нужен праймер. Роль праймера в зараженной клетке играют для ретровирусов определенные тРНК, в данном случае лизиновая тРНК. Ее 3'-концевой фрагмент комплементарен определенному участку геномной РНК, который называют праймерсвязывающим участ"ом (РВ). Он находится вблизи 5'-конца геномной РНК, соседствуя с участком, обозначаемым как В„за которым следует находящийся на 5 '-конце на участок )(, идентичный участку, находящемуся на 3'-конце геномной РН1<. Так что на нервом заре происходит обратная транскрипция всего-навсего небольшого кусочка РНКовой последовательности и процесс на этом мог бы просто оборваться, остался бы прочный дуплексный участок на 5'-конце геномной РНК.
Этого, однако не происходит, так как в работу включается Н-РНКвзная активность. Прочитанная информация в виде фрагмента й — Вэ уничтожается, и возникает ДНК- фРагмент, комплементаРпый УничтоженномУ фРагментУ ((-Вы котоРый обозначают как 1('-В;. Затем на ферменте происходит новый пируэт — )(' перескакивает на имеющийся иа противоположном конце геномной РНК комнлементарный у участок ((, образуя нраймер для продолжения работы обратной транскриптазы, П Последняя получает теперь возможность провести обратную транскрипцию ° РНК , й,.
Геле»вал РНК е' (+ цепь) а мв й теа» тРНН св я а' ам,вв тРНК ипмЯ вв й всей оставшейся части геномной РН1<, в том числе, вытеснив тРНК, переписать в виде ДНК участок ВР связывания праймера. Так как зта ДНК является комплементарной копией геномной плюс-РНК, то она должна рассматриваться как минус-ДНК. Получается полная ДНК-реплика гепомной РНК вируса с тРНК на 5 '- конце. Информация с геномной ДНК улсе считана. Но для получения второй пити ДНК (плюс-ДНК, с той же последовательностью, что и геномная РНК) все еще нужен праймер. Он создается специфичным разрывом оставшейся части РНК в участке, предшествующем фрагменту Вз, который находился на ее 3 -конце перед К.
В результате этого формирование плюс-ДНК начинается с воссоздания участка Вз-К-Ва — РВ. На этом использование РНК заканчивается, РНКазы Н завершает работу по ее деградации и фермент целиком переключается на работу в режиме ДНК-полимеразы. Начавшая синтезироваться плюс-цепь зацепляется освободившимся участком РВ за 3'-конец минус-ДНК. Это дает возможность последней продолжить элонгацию до полного считывания 5'-конца начавшей формироваться плюс-цепи.
Одновременно плюс-цепь получает возможность элонгироваться до достижения 5'-конца минус-цепи. Как видно из схемы, при этом па обоих концах линейной двунитевой ДНК возникают идентичные структуры, известные как длинные концевые повторы (1опб ьегпйпа1 гереаьз, 1ЛК), с помощью которых происходит встраивание вирусной ДНК в геном. Из приведенной достаточно сложной схемы видно, что на протяжении функционирования происходят нетривиальные события. Так, па первой фазе идат образование гибридного дуплекса участка К вЂ” Вв. Если бы в момент обратной транскрипции участка К-Ва в работу одновременно включилась активность РНКазы Н, мог бы деградировать еще не прочитанный участок геномной РНК и процесс был бы нарушен. Разрешение на включение РНКазы В должно даваться только по завершении обратной транскрипции на 5'-конце геномной РНК. Нетривиальным событием является скачок, совершаелзыт1 геномной РПК после освобождения фрагмента ДНК от РНК.
Важным и нетривиальным событием является последующий разрыв геном ной РНК в определенной точке перед фрагментом Ва, чем задается структура длинного концевого повтора. Опять-тани нетрудно заметить, что вопрос о переключении активностей в Пределах одного Работающего фермента также требует рассмотрения с позиций молекулярной динамики. Таким образом, несмотря на большие успехи молекулярной энзимологии в изучении структуры комплексов фермент — субстрат, перед этой областью биохимии стоят новые, еще более сложные задачи, без решения которых ни понимание молекулярного механизма работы ферментов, ни принципы конструирования искусственных ферментов не будут достаточно полными.
Цв й , .„, „,...„, а +авк ям а'г- т-ч" щ" рис. 88. Работа обратной транскриптазы на примере фермента из вируса ВИЧ-!, вызывающего СПИД: у— — синтез минус-цепи ДНК, содержащий в качестве праймера тРНК; 2 — гидролиз РНКазой НУзаьтна плюс-цепи РНК, содержащего й и Оз; У вЂ” первый сна юк. Образование дуплекса 3 -конца плюс-цепи Рнк и я -фрагмента вновь синтезированной минус-цепи днк и начало синтеза минусцепн днк, з — злонгация синтеза минус-цепи днк; б — образование ника в Рнк в точке, пред— ~тзующей участку Ов; 6 — синтез плюс-цепи ДНК и образование ОЗ, К, НЗ, РВ области, компле~нтарией Оз, Н, 0в, 7 — РаСЩЕПЛЕНИЕ тРНК-фРаГМЕНта МИНУС-ЦЕПИ РНКаЗОй Н; З вЂ” ЗаВЕРШЕНИЕ скн'теза плюс-цели дНК; Р— завершение синтеза двукцепочечной дНК Задач и Концентрация г)(рТр4), моль/л Начальная Концентрация сСМР, моль/л Начальная Концентрация с1(рТр4), моль/л Концентра- ция сСМР, моль/л скорость гидроли за, ЬАгаг/мин скорость гид!уолиза, гУАгаг/мин 4,2.10 -' 3,9 1Ог З,З 10г 3,4 ° 10 г 2,9 10"г 2,7 1Ог 7 1Оч 0 ),1 1Ом 3,5 ° 10 ч 5 ° 10 4 0 1,1 ° 1О м 3,5 ° 10 4 СНгОН Н У С 0 н — -он ьНгОРОг Нгорог 4,4 ° !О г 4 0.10-г 36 1Ог 3,8 ° 1О г 3,5 ° 10 г ЗО 10г 8.!О 4 6 104 0 1,1 ° 1О 4 3,5.10 4 0 1,1 ° !О ч 3,5.
10-Я 4,8.10 г 4,4 10 г 4,0 ° !О г 1,0 1Ог 0 1,! ° 10 4 3,5 ° 10 ч с! испо импульсов в минуту при концентрации (моль/л) (рАТ)лорАС Время, мин 1.05 1О а 2,! ° 10 а 4,2.10 8 84 !Оа 63!Ол 1 2 3 5 13 383 24 943 35 662 49 964 59 497 25 478 42 748 65 048 97 О!6 116 614 19 783 38 056 59 !79 70 630 93 061 23 807 79 085 109 354 125 468 26 8!6 57 190 86 223 114 023 !45 278 6.1. В активном центре лактатдегндрогепазы обнаружены следующие аминокислотные остатки, участвующие в связывании пирувата: 4г8-171, Пла-!95, (ар-168 и 4гб-109. Изоб. разите гипотетическую модель взаимодействия пируаата с этими остатками и вытекаюцгий из этой модели механизм переноса гидрид-иона. 6.2. Триозофосфатизомераза каталнзирует реакцию изомеризации между дигидроксиацегонфосфатом и О-глицеральдегидфосфатом: Известно, что фермент работает без участия нофакторов и без образования промежуточных продуктов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
