Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Положительно заряженные остатки аргинина взаимодействуют с С-концевой карбоксильной группой. Это взаимодействие является главным фактором, обеспечивающим селективность кврбоксипептидазы именно к С-концевым аминокислотам. Гидрофобные компоненты активного центра обеспечивают преимущественную фиксацию в нем гидрофобных С-концевых остатков. Уже из этого рассмотрения становится ясной абсолютная стереоспецифичность фермента — при аналогичной посадке 0-аминокислотного остатка в сторону каталитического центра — координированного иона 2п' — будет направлен атом Н при хиральном атоме С. Дополнительно стереоспецифичность обеспечивается формой полости, в которой происходит фиксация субстрата.
Внутренняя поверхность полости в направлении связанного с хиральиым центром С-концевой аминокислоты атома Н достаточно близка к нему и не допускает замены его нв какой-либо превышающий его по размеру фрагмент без существенной деформации полости.
Поэтому даже связывание С-концевого фрагмента в 9-конфигурации затруднено. В случае карбоксипептидазы А аминокислотные остатки апофермента, как и в случае рибонуклеазы, обеспечивают отбор и нужную ориентацию субстрата относительно активного центра. Кроме того, специальные остатки аминокислот участвуют в связывании кофакторв — иона цинка. В белках отсутствуют какие-либо группы, способные участвовать в окислительно-восстановительном катализе. В тех случаях, когда такой катализ необходим для осуществления окислительно-восстановительного превращения, в качестве кофакторов используются ионы металлов переменной валентности или специальные органические молекулы, такие как гем (1) и флавиновые коферменты (68 а, б и 69).
Во всех случаях, как это видно на примере карбоксипептидазы А, белок организует работу кофвктора наиболее эффективным образом. Более того, в зависимости от структуры белка может усиливаться одна нз присущих кофактору нескольких функций, в результате чего в разных комплексах один и тот же кофактор играет существенно разную роль. Например, гем в комплексе с глобином в незначительной мере проявляет свою склонность к окнслительно-восстановительным превращениям и функционирует в основном как комплекс, координирую~ций молекулу Ст.
В хаталазе в комплексе с соответствующим апоферментом он проявляет способность катализировать двухэлектронное окисление — восстановление НтОт. В цитохроме с тот же гем выполняет функцию однозлектронного переносчика, меняя в каждом акте переноса электрона состояние иона железа от Те(ГЬ) к Ге(111) и обратно Таким образом, из прппеденных примеров следует, что белок в роли фермента или апофермента принимает участие в выполнении четырех главных функций. Во-первых, белок обеспечивает специфичное опознавание субстратов, приводящее к образованию комплекса, в котором реагирующие части этих субстратов необходимым образом ориентированы относительно каталитического центра.
Во-вторых, он принимает участие в каталитическом акте своими кислыми и основными группами по механизму общего кислотно-основного катализа. В третьих, в ряде случаев коввлентно связывает часть молекулы субстрата с образованием промежуточного продукта, выступая в этом случае в качестве нуклеофильного катализатора. В-четвертых, в качестве апофермента белок обеспечивает связывание в активном центре иона или молекулы кофактора. 207 Этим функции белка как фермента нлн апофермента скорее всего не исчерпы ваются. Все рассмотренные механизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре, Это ие совсем верно, Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фактором ферментативного превращения.
В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью рентгеноструктурного анализа. Например, карбоксннептидаза А была под вергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-! тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается прн связывании этого субстрата, т,е.
наблюдается отчетливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется н имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конеформации, существенно более близкой но своей геометрии к актнви(юванному комплексу реакции, чем копформацня субстрата, преобладающая у несвязанных л(опекун. Это, естественно, должно приводить к снижению активацнонного барье1эа реакции и способствовать существенному ускорению превращения. Изучение механизма действия ферментов как с целью выявления обншх принципов ферментатннного катализа, так н для установления деталей л1ехапизмов отдельных конкретных ферментатпвных реакций остается одной пз центральных задач теоретической бпохнмпп.
Наряду с огромным мировоззренческим значением эта задача п1любрстает больштио практическую ъшчнмость, поскольку открывает перспективу сошштельпого конструирования болсг совершенных молекул ферментов и апоферментов. Спроектированные молекулы могут быть затем получены путем хиьшческого синтеза соответствующих полипентндов плп методами генетической и белковой инженерии, которые вкратце рассматриваются в $7.11. 6.2. ОСНОВН1нВ ПРИНЦИПЫ КИН(УГИКИ ФВРМКН'ГЛГИВНЫХ РВЛК1(ИЙ Ферментативное превращение происходит в коннлексс фернеюн — субсн1ра~н и может в достаточно хорошем приближении рассматриваться как мопомолекулярное превращение шаго комш|екса. Это превращение может в терминах ! 3.10 рассматриваться как ответ системы на образование комплекса, и для описания можно воспользоваться приведенными в этом параграфе соотпошенпяьш. В энзимологии по традиции принято использовать несколько другие обозначения Фермент (энзим) обозначают буквой Е, а спеши)>пческнй лш'анд, субстрат ферментативного превращения, — буквой Я.
Кроме того, обычно для харакэтристпкн комплексообразовапня используют не константу ассоцпаш, а константу днссоциации комплекса Рг С учетом этих обозначений для типичного случая, когда полная концентрация субстрата з намного превосходит полную кокпептрацщо фермента (Е], выражюше для концентрации комплекса фермент — субстрат на основании уравнения (3.6) заннн1ется в ниде ! м СЕВ] = „„,, (6.!) а выражение для скорости н ферментатнвпой реакции — в виде йк атсЕ] ! + ('(5/а) (6.2) й1 Е+Я ЕБ -1 (6.3) хат Е+ р йкат Здесь Р— продукт реакции.
Условие квазистацпонариости при этом записывается в виде )3 (.Е] (Б] = (с-1 РЕ] + йкат СЕБ] (6.4) нлн с учетом того, что я+С ']жя в виде )3 (Е]~!Б] = ()сч + йкат + !3!Е]) !ЕБ] н, следовательно, концентрация комплекса после установления кназистапионарно- го режима будет равна !'] Б] М ч + йаат+ )1 Б ! + ь1 + ахат ' -т;1с!— а скорость ферментативного превранге|шя й„„,м + )'.1 + Екат Л, ~Б] (6.
6) Это выражение прп концентрации субстрата, существенно превышаюгцей концен- трацию фермента, по характеру зависимости скорости от концентрации субстрата 3 идентично (6.2), однако вместо константы днссоцнацин комплекса стоит вес- ко"ысо более сложная величина где )сваг — константа скорости превращения комплекса Фермент — субстрат в продукт реакции с регенерацией свободного фермента. Более строгое рассмотрение должно у штывать, что соотношение между свободными ферментом и субстратом и пх комплексом не является равновесным. Комплекс ЕЗ не только дпссоцппрует, но и претерпевает превращение в свободный фермент и продукт реакции Поэтому следует говорить не о термодинамически равновесной концентрации комплекса, а о его квазистационарной концентрации, которая устанавливается вскоре после начала превращения в результате выравнивания скоростей образования и расходования комплекса по обоим путям.
Для этого нужно записать схему процесса в несколько усложненном виде: Кч> + йкат Км = [Е1 [Б) Ем = ~ду Из (6.6) следует, что по мере увеличения концентрации субстрата при неизмен- ной концентрации фермента скорость стремится к лредельному значению, кото- рое в энзимологии принято называть х>пкси ив«»ной скорогшлкх )>пах = )скат [Е]1 ° (6.8) С учетом этого выражение (6.5) можно записать в виде ! п>ах (6.9) 1+ Ки/в ' В такой форме оно известно в биохимии как ураагссяие >11иха»лиса — >)ге>>>не>1.
Тах как задаваемая им зависимость и от а ио характеру идентична завишцюсти ответа системы от концентрации специфического лпганда, то уравнение Михаэлисп может быть представлено в виде линейных аиаморфоз, аналогичных (3.13) н (3.14), которые в обозначеиинх, принятых в эизимологии, имеют ви(с + Аи/!пнх (6.! О) уп + и = У х-К„-, х (6.11) Для иллюстрации на рис.
63 приведена в координатах 1/и — 1/э зависимость скорости гидролиза карбобеизилоксиглицилфеиилалвинна, катализируемоге карбоксинептидазой А, от концентрации субстрата. На ряс. 64 в координатах э т па пе пп !>л гк пъ>«Г> х и го и Спэ>МП>1: Рнс. 64.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
