Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Зависимость скорости гидрплиза аденоэиктрнфосфата, каталкэируемого мне«ином, от концентрации аденозинтрифосфата в координатах и — и/» (по данным Лейдлера) Рн< 63.:1«кнсимпгть скорости гкдролиз« карбпб>енчнчоксигчнднлфенил«,чаннн« аод действием кпрбпнгинпнтндпс>Ы От ьонцпнтр«ции субстрат«в координат«х !/г — !/» (по данным Кауфм«н«и Нед-. р«тк) 210 называемая ног>стахи>ой Миха»лиса, Сравнение с (6.4) показывает, что зта константа характеризует соотношение между концентрациями Е, Б и ЕБ в условият квазистационарности (6.7) и — и/а приведена аналогичная зависимость длн гидроянэа ЛТФ, катализируемого мышечным белком миозином, который принимает непосредственное участие в нревращении избыточной энергии нирофосфатной связи ЛТФ в механическую энергию мышечного сокращения.
Схема (6.3) является простейшей схемой фермеитативного превращения. Согласно ей фермент пребывает в двух состояниях — в свободном виде, когда его функцией является отбор молекулы субстрата, и в виде ссомнлекса с субстратом, когда его функцией является собственно фермецтативиое иревращеиие. По мере повышения концентрации субстрата а среднее время, необходимое для эффективной встречи с субстратом, уменьшается, тогда как время внутрнмолекулярного вревращеиия комплекса в ферлсент и продукт остается иеизмеинылг. Достижение максимальной скорости означает достижение столь высоких значений а, что время на встречу свободного фермента с субстратом становится малым ио сравнению с временем каталитического превращения, т.е. времени иа поиск очередной молекулы субстрата фермент практически не затрачивает.
Константа Михаэлиса в определенной мере характеризует сродство фермента к субстрату, Так как зта величина является аналогом константы диссоцивции комплекса ЕБ, то чем ниже Км, тем выше сродство. В то же время Ки, как следует нв (6.6), превышает константу диссоциацни комплекса ЕБ. 1(ак видно из уравнояия (6.9), Км численно равна значению а, при котором достигается значение скорости, равное неловкие от упек. Данные по зависимости и от » в квазистационариом режиме позволяют определить значения двух параметров: Клг и !пп,„ ч>х>, в свою очередь, двгт возможность вычислить константу скорости каталитического превращения 1«;сс Значения 01 и Й 1 но отдельности из этих величин ие определяются и могут быть найдены лишь при постановке слецнальных экспериментов, нанримор наблюдения за нинетикой превращения субст!эата в период установления кназистационариого режима (предстационариая кинетики).
этот период, как правило, изл>еряется Малыми долями секунды, поэтому применяют энсигримгптачьпые методы кш>етики быстрых реакций — метод остановленного потока и лготод те>иге!>«ту!экого скачка. Изложение теории и эксиеримегпальиой техники этих методов выходит ва рамки данного курса. Схема (6.3) является простейшей, так как предполагает участие в реакции одного субстрата и необратимость реакции.
Уже для односубгтрнтиой обратимой Реакции схема усложняется и число кииетичсских иарюктрои, необходимых для ае описания, возрастает. Усложняетсн и вид кииетичес>сото урав>юиия, Еще в большей мере это относится к двух- и трехсубстратиым ренюцшлс. Систематическое изложение этого вопроси можно найти в специальных рукож>яствах но кинетнке ферментативных реакций. В качестве примера более слож>юго случая ниже Рассматривается необратимая реакция, протекаю>ц«Я С Участиел> ДнуХ сУбстратов Б> и Бэ, причелс предполагается, что имеет место ои!эгделеииь>й порядок их присоединения, а именно: гнпчвш присоединяется Б> с обраюк>вием ко>алекса ! Б>, а затем уже Бэ с образованием полного колшлекса, в котором и происходит фермеитативное превращение.
Схема записывается в виде 01 Е+ Б> ~~ ЕБ 1 211 ЕЯс + Бг 5 ЕЕс5г "-г кат Е+ Р /с Кинетическое уравнение в этом случае имеет вид е = 5кат[ЕНс5г] ° В случае достаточного избытка субстратов иад ферментом концентрация трех- компонентного комплекса может быть выражена через полную кассцентраципг фермента, полные концентрации субстратов Ес и Нг, кинетические параметры, условия материального баланса по всем трем ферментным формам Е, ЕЕс и ЕНс5г и условия квазистационарности по промежуточным калсплексам ЕЕс и Е5с5г'.
[Е] + [Е5с] + [Е5с5г] = [Е]ь йсес [Е] + /с-г[ЕНс5г] = А'-с[ЕЕс] + йгэг[ЕБс] )сгэг[ЕЕс] = ~-г[ЕЕс5г] + йпат[ЕЕс5г] После несложных алгебраических выкладок получается уравнение для необратимой двусубстратной ферментативной реакции с определенным порядком присоединения субстратов в виде л к ат [Е] с (6.12) 1 1 1 й-с+!хат! 1-! 5-с+ лиат!1 ' 1+ — — + + 1г эс эг При достаточно больших концентрациях обоих субстратов достигается значение максимальной скорости Рл „, равное, как и в случае односубстратной реакшоп йпат[Е]с. Из экспериментально найденной зависимости в от эс и эг могут быть найдены параметры хват, /сс, сс с/Ас, т.е.
сс-с и (1.г + апас)/ссг. Последняя величина представляет собой константу Михаэлиса для второго субстрата. Даже простейшее кинетическое уравнение ферментативной реакции содержит несколько кинетических параметров, каждый из которых зависит от температУРы и среды, в которой протекает реакция, в первую очередь от РН и ионной силы Если эксперименты проводятся в присутствии органических растворителей, тп кинетические параметры также зависят от природы добавленного растворителя и его содержания в растворе. Характер всех указанных зависимостей различен длп разных ферментов. Ниже вкратце расслютрены вопросы, связанные с влиянием Р)~ раствора и температуры на скорость фермептативпых реакций. Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне РН и характерп зуютсл некоторым оптимальным значением РП, при котором при прочих равны" условиях скорость реакции имеет наибольшее значение.
Причины такого характе ра зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролнза цитидин-2' 3 фосфата, катализируемого панкреатнческой рибонуклеазой. Как следует из Рнс 60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расшпп леиия РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой аст остаток имидазола, принадленсащий Пгп-12, протонирован и способен подать прагг аюп ащпй на атом 2'-0 циклофосфатного фрагмента, а остаток импдазола, принадлежащп Нгв-119, не протонирован и способен принять протон у атакуюсп ошей молекулы воды. Естественно, что ни в существенно кислой среде, когда оба остатка гистидина протонированы, ни в существенно щелочной среде, когда аба остатка лишены протонов, каталитнческое превращение осуществляться не будет. Процесс возможен лишь в некоторой промежуточной области, в которой содержапне монопротонированной формы достаточно велико.
В общем случае можно высказать следующее положение: каталитически активпай является только та часть молекулы фермента, у которой группы, принимасащие участие в общем кислотном катализе, протонированы, а принимающие участие в общем основном катализе — не протонированы. Доля каталитически активной формы фермента в связи с этим зависит от РП раствора, и именно зто является главным фактором, определяющим влияние р~ на скорость ферментатнввой реакции. В свете сказанного выражение для максимальной скорости реакции можно записать в виде (6.13) где аскет! — истинная, не зависящая от РН константа скорости каталитического хат превращения в комплексе субстрата с каталитически активной формой о, Е5 доля этой формы.
Конкретный вид зависимости а — РН зависит от того, скольЕ5 ха н каких именно групп, состояние протанпровапня которых существешю для каталитического превращения, имеется в активном центре фермента. Для случая ппнкреатической рибонуклеазы эта величина может быть засшсана в виде (6.14) где Хс и сс" — константы иоппзацпп протоппровапных имндаюльных циклов ос- заткав Нгв-12 и Н(в-119 и составе комплекса фермент — цикла<)юсфат. Значения соответствУющих РН пРи 25'С, найденные из зкспеРнмептальной зависимости 1„ат япя гндролиза цитидип-2 ',3'-циклофосфата, составляют: Р1'; = 9,0, РЛ'; = 6,15. Сходная, хотя и несколько более сложная, картина получается и для зависипасти от РН константы Мнхаэлпса. С учетом активной в связывании субстрата яелн свободного фермента а и доли формы активной в связьсвапии субстрата а Е 5 Условие квазистационарностп для комплекса фермент — субстрат можно записать и виде Нсистс а.
[ЕН] + Нсистс а [Е5] Нсисгса а [Е] [5], (6.15) мат ЕН и Нс "ст' — истинные, не завсссящпе от РН константы скорости ассоци- -1 лпвн пян и диссоциацнн комплекса ферлкпт — субстрат. Сопоставление этого выражения с " с (6 7) позволяет записать вс,срюссессссе для константы Мнхаэлиса в виде (6.16) Е 5 !',5' те. вве вести понятие истинной, не зависящей от РП константы Мпхаэлиса А„'ест' э э! К +к7КХ Я 8 о = 1'кат[Е1у 1+ — '+ —, + /) —,.
ХЯ Х! Х8ХЬ (6.17) (3.19): 1+ —, 1+ —. е = йкат!ьЕ]г (6.18) + Е !+К (6.19) е = !',как — Хм 1 + ~— ; (6.20) 216 2!7 Наконец, третья группа — вещества, которые взаимодействуют с дополнительными центрами фермента, не совпадающими с активным центром, причем это взаимодействие, изменяя коцформацию в районе активно о г центра, влияет на кинетические параметры процесса. Эти дополнительные центры называют регуляторныии, а сами соединения — аяхас~пс!тически~ив эффслтиоражи, У различных ферментов наблюдается и аялосшерическая аюниоиция, и аллостераческое ищибировипкс Эффекторы этого класса имеют вюкное биологическое значение, так как с их помощью осуществляется один нз главных механизмов регуляции каталитнческой активности.
Целевые, с точки зрения живого организма, продукты обычно образуются в результате цепочки биохимических превращений. Если этот продукт оказывается в недостатке, необходимо усиление работы системы ферментов, приводящих к его образованию В случае накопления достаточного количества этого продукта целесообразно выключение всей системы приводящих к нему процессов. Поэтому в такие цепи, как правило, включены один или несколько процессов. регулируемых ферментами, подверженными аллостерической регуляции. В качестве примера можно нрикестн фермент Росфофуухтелияизу, катализирующий перенос остатка фосфорной кислоты от АТФ на атом 01 фруктово-6- фосфата: СНтОН-СО-СНОН-СНОН-СНОН-СНтОРОт + РРР— Аоо О>РОСН~-СΠ— СНОН вЂ” СНОН-СНОН-СНзОРОз + РР-Ас(~ Данное превращение является одним из этапов мцогостадийного процесса, в результате которого происходит сонряженное окпсленис глюкозы и фосфорилирование АДФ с накоплением АТФ (з 8.2; 8.4; 8.5). Весь процесс, приводящий к образованию на одну полностью окисленную молекулу глюкозы 38 новых нирофосфатных связей (в рассматриваемом нроцессо одна нз таких связей разрушается, но это с лихвой компенсируется нослсдующимн актами фосфорнлнрошшия АДФ), имеет своей главной целью пополнение эцергетн ~вских запасов биологической системы в быстро утнлнзнруемой форм<, т.е, в аиде ппрофосфатных связей АТФ.
Поэтому при накоплении в системе достаточного количества АТФ процесс целесооб!эазно выключить или, но крайней мере, притормозить. Это н имеет место в случае фосфофруктокнцазы. Наряду с центром связывания АТФ как субстрата в шстнвном центре фермента имеется дополнительный центр, связывание с которым молекулы А'1'Ф приводит к аялостерическому торможению реакции образования фруктово-1,6-дифосфата. Вместе с тем расходование АТФ иа процессы фосфорилирования и энергетические потребности живой системы сопровождается наконлением АДФ и АМФ, поэтому повышение концентрации последних свидетельствует о дефиците АТФ. В соответ< ткни с этим моно- и днфосфат аденозина являются аллосторпческими активаторами фосфофруктокиназы. В простейшем случае одиосубстратной реакции, катнлизнруемой ферментом, состоящим из одной субъединицы, в квазиравновесном приближении кинетическое уравнение для скорости реашши в н!шсутствии эс)к(кктора нетрудно ползчить из выражения (3.18).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
