Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Какие аминакислотные остатки могут участвовать в формировании активного центра фермента? Предложите гипотетическую модель активного центра. 6.3. Обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза иатализирует синтез нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), используя в качестве матрицы РНК. За скоростью реакции полимеризации следят по включеншо радиоактивного нуклеотида. Исходя нз данных, представленных в таблице (число импульсов в минуту в пробах, отбираеиых через опРеделенное вРемЯ), опРеделите кинетические паРамегРы Кл, и Умма длп УндеканУклеотида (рцТ)лорпС, кспользуемого в качестве затравки на полн (4) матрнпе. Удельная активность ррр — (гП) Т составляет 9 !О!а тБк/моль, эффективность счета — 30%, объем проб— 10 мкл. ОА. Панкреатическая рибонунлеаза каталпзирует гидролиз фосбюдиэфирных связей РНК по двустадийному механизму с образованием промежуточного соединения — циклического-2',3'-фосфата (ель уравнение (71.1)). Для исследования ингнбирования рибонуклеазы дезокспдннукпеотидом А(!лТр4) в качестве субстрата использовали 2 ', 3'-цикло-СМР.
При гидролпзе циклофосфата до 3 '-СМР наблюдается измен< ние поглощения кри 292 нм ллАгаг, что позволяет следить за гидролпзом спектрофотомегрпческим методом. Из данных, представленных в табмипе, определите Ки для 2 ',3 '-цпкло-СМ Р, К, для А(рТр4) " тип ингибирования. 228 6.5.
В ряде случаев кинетические исследования ферментативных реакций удобно проводить в условиях избытка г)>ермента по отношению к субстрату, т.е. (Ц г Э з. Выведите для этого случая уравнение Михаэлпса — Мснтен для текущей и начальной скоростей. 6,6. Двусубстратная реакция протекает с участием двух сильно различающихся по своей структуре субстратов. Как люм но определить порядок присоединения субстратов к ферменту, используя поочередно не способные к превраигенило структурные аналоги одного и другого субстрата? Выведите соответствующие уравнения в предположении о квазиравновесии всех участвующих в процессе комплексов. 6.7. Используя значелшя рК для участвующих в катализе остатков гистидина, определите, при каком значении рП )мах для панкреатпческой рибонуклеазы достигает максимального значенил и в каком интервале значений РП 1аа„уменьшается не больше чем на 10% от максимального значения. ГЛАВА 7 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ Биохимия является одновременно и биологической, и химической дисциплиной.
Биологической она является в первую очередь по природе изучаемых ею объектов, которые представлены веществами животного, растительного и микробного происхождения. Биологической она является и по тем конечным целям, во имя которых проводятся биохимические исследования — познание свойств н выяснение механизмов функционирования веществ, из которых построена живая материя. В то же время, будучи наукой о 'веществах н о протекающих с их участием химических превращениях, биохимия по своей методологии является химической дисциплиной. Она использует разнообразные методы, которые предоставляют в ее распоряжение фундаментальные химические науки — неорганическая, органическая, аналитическая и физическая химия, а также химия высокомолекулярных соединений.
В то же время природа исследуемых объектов, особенности решаемых задач накладывают свою специфику на использование этих методов, на их относительную значимость. Наиболее выпукло зти особенности проявляются при исследовании нерегулярно построенных биологических полимеров— белков и нуклеиновых кислот, которые являются более высокой формой организации материи, чем низкомолекулярные соединения и регулярно построенные гомополимеры, также широко представленные в живой природе, в первую очередь различными полисахаридами. Становление биохимии как основополагающей биологической дисциплины началось с исследования веществ, существующих в живой природе, и химических процессов, происходящих в живых организмах.
Поэтому среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют выделение веществ из биологических источников и, как правило, их очистка с целью получения индивидуальных соединений. Следует отметить три главные проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов, в особенности наиболее сложных компонентов — белков и нуклеиновых кислот. В значительной мере это касается и получения искусственных белков и нуклеиновых кислот, которое стало возможным в последние десятилетия.
Во-первых, исходный материал — биомасса, из которой предстоит выделить интересующее исследователя вещество,— состоит из многих сотен или даже тыся" различных соединений. Разделение таких смесей по уровню сложности не имеет себе равных среди других химических дисциплин. Это дополнительно усугубля 230 руся тем, что многие компоненты этих смесей, выполняя различные биологические функции, построены довольно однотипно. Например, смесь иммуноглобулинов в сыворотке крови представлена набором огромного числа белков различной специфичности, но они мало отличаются между собой по аминокислотному составу В сввзи с этим они мало РазличаютсЯ междУ собой н по таким физико-химическим характеристикам, как растворимость или способность поглощаться определенным типом сорбентов, и поэтому для их разделения не могут быть использованы классические методы — осаждение, зкстракция, адсорбция на традиционных сорбентах.
То же можно сказать и о разделении смесей информационных рНК, которые могут быть представлены в используемом биологическом материале сотнями различных по структуре, но близких по своему нуклеотидному составу молекул. Во-вторых, работа с биохимическими объектами, которая касается не только методов выделения и очистки, но и многочисленных исследовательских работ с ними, особенно с белками и нукленновыми кислотами, заключается в необходимости манипулировать с очень маленькими количествами вещества — миллиграммами, микрограммами и даже значительно меньшими. При выделении это связано с незначительным содержанием многих компонентов в исходной биомассе, а также в ряде случаев с ограниченным количеством биомассы, например при исследовании редко встречающегося животного или растения или очень мелких живых объектов, которые иногда добываются поштучно н доступны в небольшом числе.
Как при выделении, так и в ходе различных исследовательских процедур необходимо осуществлять детекцию выделяемых или исследуемых веществ. При ничтожно малом количестве материала используемые для детекции методы должны быть высокочувствнтельными. Поэтому в биохимии редко используются такие классические приемы аналитической химии, как гравнметрический или объемный анализ. Основными методами детекцнн являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении поглощения видимого нли ультрафиолетового света, радиохимические методы, основанные на измерении радиоактивности, и люминесцентные методы, основанные на измерении флуоресценции, био- и хемилюминесценции.
В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить тот илн иной биополимер в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность, состоянии. Между тем многие белки и высокополимерные нуклеиновые кислоты прн умеренных температурах и незначительных изменениях рй среды подвержены необратимому изменению конформаннн — денатурации, которая обычно сопровождается потерей биологической активности — инактивацней. Кроме того, в клетках часто находятся ферменты, способные разрушать те или иные вещества. В первую очередь это относится к белкам н нуклеиновым кислотам, так как клетки обычно содержат ферменты, способные каталпзировать гидролиз этих биополнмеров, — протеазы и нуклеазы.
В неповрежденных клетках эти ферменты преимущественно сосредоточены в специальных гранулах — лизосомах. Однако при разрушении клеток или тканей; которое всегда предшествует началу работ по выделению интересующих исследователя веществ, лизосомы обычно разрушаются, ферменты выходят наружу, что приводит к быстрому разрушению биополимеров уже в исходной биомассе. Наряду с применением классических химических методов развитие биохимии 231 открыло принципиально новые возможности для проведения ер исследований.
При определении первичной структуры белков и нуклеиновых кислот (см. 8 7.7 и 7.8) необходимо расщепление исходных молекул на фрагмев ты меньшего размера, причем для получения гомогенных фрагментов нужно провести расщепление по строго определенным точкам. Это в основном достигну то в случае белков вследствие применения специальных протеза, таких, как трнп син, химотрипснн, зластаза, а в случае нуклеиновых кислот — с помощью специ альных эндонуклеаз-рестрикции. Химический синтез генов позволяет достигнуть полинуклеотидов длиной в несколько десятков или одной-двух сотен нуклеотидных остатков. Получение более длинных цепей оказалось возможным вследствие соединения синтетических фрагментов в помощью фермента ДНК-лигазы (см, 8 5.4).
Синтез больших молекул РНК стал возможным при использовании транскрипции синтетических генов с помощью РНК-полимераз, среди которых особенно эффективными для этой цели оказались РНК-полимеразы бактериофагов Т7 и 8Р6. Но особенно революционизирующее влияние на экспериментальные возможности биохимии оказало применение ферментов матричного биосинтеза, в первую очередь ДНК-полимераз.
Аналитические возможности в биохимии нуклеиновых кислот неизмеримо возросли с появлением амплификации, т.е. размножения молекул ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. Применение прямой и обратной транскрипции позволило перенести многие методы, разработанные применительно к ДНК, на рибонуклеиновые кислоты (см. 8 7.6). Способность живых организмов и самих молекул ДНК к размножению открыла широкую дорогу селекционным методам для решения биохимических задач.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
