Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Применительно к рибосомам это уже отмечалось в 3 3.8. Описанные выше методы по своей сути динамические, разделение происходит па мере перемещения веществ вдоль системы. Наряду с ними применение нашли Равновесные зональные методы, в которых система приводится в равновесие с «екоторым приложенным внешним полем — электрическим или центробежным— я зоны, соответствующие разным веществам, останавливаются в разных участках Системы. Наиболее широкое применение нашел метод иэоэлектричесхой фокусировки. Оя основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента РН, причем значение РН возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещается в том или ином направлении в соответствии со эяаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение РН совпадает с его иэоэлектрической точкой.
На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его эаРяд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный "Рэдиент РН, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналог агнчен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахаРоэы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из уяастка, на котором РХ = р1, в сторону катода, он пол падает в область более высоких значений РН и заряжается отрицательно.
Под 243 (7.4) действием электрического поля он должен начать перемещаться к аноду, те вернуться на исходяый участок. То же самое происходит и в случае диффузии в сторону анода. Если сочетать эту процедуру с использованием полиакриламидно го геля, то зоны получаются очень узкими и внешне напоминают изображение хорошо сфокусированного пучка, с чем и связано название метода. Для создания стабильного градиента РН используют специальные вещества получившие название амфолинов.
Это смесь коротких полимерных молекул, содержащих в различных соотношениях карбоксильные и аминогруппы. Иными 'словами, амфолины — это смесь молекул амфотерных электролитов с разными значениями изоэлектрических точек. В постоянном электрическом поле онн пе вмещаются в растворе или в геле до достижения зоны, в которой их суммар- Р ный заряд равен нулю, после чего до тех пор, пока приложено электрическое поле, они будут оставаться на месте.
На этом участке они играют роль буферного компонента, поддерживающего стабильное значение РН. В ентробежном поле можно создать стабильный градиент плотности раствоц рителя. геля. Как известно из теории седимснтации, вследствие диффузионного размы. вания границы седиментации в конечном итоге в центрифужной ячейке устанавливается равновесное распределение концентрации каждого компонента, описываемое уравнением с = со ехр (- яьоэ 11 — (ро/р)] (э'о гх)/(21сТ)), где с — концентрация в точке, находящейся на расстоянии г от оси ротора; со— концентрация на дне ячейки, находящейся на расстоянии го от оси ротора. Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 — ро/р станет равным нулю в дальнейшая седиментация прекратится, т.е.
возникнет устойчивая зона нахождь ния биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного Рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекульэ ДНК из одного вида микроорганизма, выращев- 14)Е в ные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония эвНН, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, р азличные плавучие плотности.
Поэтому при раопооеспож ченпьрифусирооании и срадосье гпе пяотпосгпи хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера р епликаиив ДНК приведен в з 5.1. Все описанные зональные методы — одномерные, разделение в них прои сходит по одной координате. Наряду с этим, особенно для аналитических цел й, р е,п име ияют доужерньье сисгпсяи раэделекия на пластинках. При этом разде е ую ля м смесь в виде пятна наносят на один из углов и разделяют в одном направл енин. Затея 'кс .' кс.
69. Двумь ркыи соп ктрофореэ и поли»крклкмклком геле при рН 8.2 (1-е к»лр»влепив) и прм рН 4,0 (2 п»пр»каске ) смеси белы в. вьшеь клык кэ рибосом Е.соб (по лакпым Г.Г. Карповок); в — фотография ге»я пес»е окркшмв»ния кр»сктеяеьс 6 — схем» ркспс:.эо,ьеныя пятен ркбосомкмх бе»ков в ге»е какие-либо параметры, определяющие разделительную способность системы, изменяют и проводят разделение в перпендикулярном направлении.
При удачном подборе системы и условий разделения удаегся разделить те компоненты, которые не разделились при первой процедуре. Комбинации методов могут быть довольно разнообразны: двумерная хроматография с использованием в разных вал вправлениях различных элюентов, хроматография в одном и электрофорез в другом направлении или, наконец, злектрофорез при различных значениях РН в обоих направлениях. При этом исходное пятно разделяется на систему пятен. В качес "естве примера на рис.
69 приведен результат двумерного электрофореза смеси осе ков, выделенных из рибосом Е со1в, ко~да в одном эксперименте раздел ются я се 53 белка, входящие в состав этого нуклеопротеида. 245 2.2. ЛФФИИНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ВИОПОЛИМЕРОВ Несмотря на многообразие и высокую разделяюшую способность методов описанных в б 7.1, они оказываются бессильными при решении задач по выделе нню индивидуальных компонентов из сложных биологических смесей.
Уже отме чолось, что иммуноглобулиновая фракция сыворотки крови состоит из тысяч различных антител, которые весьма сходны по общей структуре, что не дает надежды разделить смесь на индивидуальные компоненты традиционными методами, основанными на различиях тех илн иных физико-химических характерна тик компонентов. Единственным заведомым отличием каждого индивидуального иммуноглобулина является его специфичное сродство к определенному антигену То же самое имеет место в случае смеси мРНК, которые несущественно различа ются по нуклеотидному составу, Тем не менее они имеют различные нуклеотидные последовательности и соответственно могут обладать селектнвным сродством к олигонуклеотидам нлн нуклеиновым кислотам с комплементарными последовательностями, Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных .иешодоа разделения (от англ.
аЛТвгбу — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентоо. Специфические лнганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинноб хро иатоерафии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде.
Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособнымн группами, который ло усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствуюшего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакцнонноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромцвансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгСнйб, который реагирует с гидроксигрулпой сефарозы, превращая ее в остаток цианата: у НΠ— С= — Н + ВгСН вЂ” о + Вг-+ Н Такое производное активно по отношению к любым полимерам и низкомолеку лярным соединениям, содержащим аминогруппу, образуя соответствующее производное: + ННЫХ вЂ” а НН2 Эта реакция может происходить с различными аминами — с б-аминогруппамн остатков лизина в белках, с аминогруппами гуанина, аделина и цитозина в пухло 24б " ягель — -0 — ВЬ вЂ” !СН2)3-0-СН2СН2 — ИН вЂ” (СН2)6 — Мн ! 0 ! (~ ~'и )! М 0 — Р— 0 0 ! 0 Н Н с снлнкагелем в качестве носител сителя.
Используется достаточно длинный спейсер (СН2)е О (СН2)г ~Н (СН2)е —, присоединенный к б-НН2 аденнна. Этот сорбент способен удерживать на колонке различные ферменты, взаимо й де ствующие с и др, пецнфичность сорбента может быть повышена использованием Н40 вместо АМР в качестве а аффинной группы. Дальнейшее увеличение еелективности может быть достигнуто подборкой соответствующего злюента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
