Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 65
Текст из файла (страница 65)
П ле выхода ю п о есс СУП.1) полностью завершился. осле вы те мостата окрашенные зоны проходят через кювету фотометра, в кото термостата окраш о е жанна красителя, а тем самым и содеряз- дится количественное измерение содержа ая аминокислота в этой системе имеет оп„ вия аминокислоты. Так как каждая тауэр ленное время выхода из колонки, то идентификация аминокислот, соопзетс щих окрашенным зонам, не вызывает затруднений. и в тея ованни компонентов живой материи, в Чрезвычайно широко при исследован е ф акциояя име ов и именяются радиогиязичесиие язепзодм. В ходе чракци числе биополимеров, применяются р ут б сиены если живые оргз рования биологического матери ут б ала они могут быть применены, есл ственввя" е ж ей адиоактивные предшес ни змы выращивались на среде, содержащ р п о тов питания или при инъе „пвяз биополимеров, получали их в составе продук в 14С п во о ода 'Н (тритий), изотоп углерода Используют главным образом изотоп вод р изотопы с ра згР и ззР, изотоп серы за.
Два важнейших биогенных злеме а ы ззН и зз0, распадающиеся с испусканвз" азот и кислород — имеют изотовы и, рас гле а пС. Они являются пег онов. Так же распадаегся и изотоп углерод ЕЯЯ1' позитронов. мог афни, основанной на введ ными ля использования в позитронной томографы, 07 женин и локализации их в организме н изотопов в живые организмы и обнаружении и лок в. Поскепг излучению, возникающему при анни ци гиля и позитронов и электронов. ос абота с вап" Ку время полураспада всех этих изото пов измеряется минутами, работа с эап <М яхром> с объемом кзовепа 1 ззкл класса отечественных при ров ые могут регистрировать оптическую плотность и светового пучка 1 мм, которы ути а и порядка выше, т.е. применительно к ну порядка 0,01, чувствительность ва три п клеотидам и нуклеиновым кислот отан достигает нескольких нанограммов.
Вещества, не обладающие поглощени и ением в удобном для измерений спектральс помощью специальных химических презном диапазоне, могут быть окрашены с п ащений. Наиболее широко извес око известный в биохимии пример такого рода — превращение аминокислот в синий краситель путе и записывается в виде гидриндегидратом). ). Стехиометрическое уравнение реакции запи требует специапьной биохимической техники, позволяющей получи иэ необходимые предшественники и ввести в организм за е а весьма короткое врем~ Однако перспективы использования таких ультракоротко уп живущих радиоактивяых изотопов в биологии и медицине настолько заманчивы что ве ет , что ведется ра та, нацеленная на разработку соответствующей высокоавтоматизированной биохими„еской и радиологической аппаратуры и соответствующих процессо, ц ссов, и уже сделаны первые существенные шаги в этом направлении.
Чувствительность радиохимических методов непосредственно связана со скоро,тью радиоактивного распела используемых изотопов котору которую чаще всего характеризуют периодом полураспада С . Из основного уравне !/ ' 2 уравнения радиоактивного распада гд р д оактивных атомов в образце сз константа скор связанная с периодом полураспада соотношением й = 0,6931 1 , следует, что 1/г число радиоактивных атомов в исследуемом образце п н прн регистрируемом с помощью счетчиков радиоактивности числе распадов в единицу времени Сдп/41~ составляет и/д с — й„ и= 1,31 /2 Регистрирукзт н н ' тельность Радиохимической цян, т.е. минимальное число атомов радиоактивного материала, которое может быть с удовлетворительной точностью измерено радиохимически, имеет порядок Например, для изотопа фосфора згР, имеющего период полураспада 11 5 сут эта величина составлЯет 10 атомов, т.е, поРЯдка 10 " моль.
В табл. 7.3 приведены пе ио ы пол ас р д ур нада, тип н энергия радиоактивного излучения и пасло надежно регистрируемых молей для перечисленных выше изотопов. Для нуклеиновых кислот, прнак , у которых в пределе может содержаться по одномэ а тому на каждое нуклеотидное звено, можно дегектировать до 10 'з г вещества. Таблица73.П ио ер ды полураспада тип и энергия радиоактивного излучения, регисзрируемое количество атомов некоторых изотопов, мель Н эззоп Испускаемое Период излучение полураспада Е, МэВ Количество иэозопа, соответствующее 10 рапп/с,моль "С ЗН 153 згр ззр 1151 гз11 5770 лег 12,2б > 85,7 сут 14,3 Ъ 25 Ъ 57,4 Ъ 8,05 > О,! 5б 0,0185 О,! 57 1,71 0,25 0,035 0,6Щ 0,3б( 7) 4,39 10'з 9,57 10'з 1,31.10 ы 3,02 10 зг 5,22.!О 1" 11,98 10 '" 1,б8.10 1" В некоторых случаях удаегся подобрать для детекцин систему, которая испускает сваг в видимой или ультрафиолетовой области. Методы, основанные на измерении испускани кания снега, называют люлгинесцентныжи лгетодалги.
При достаточно высоко й интенсивности свечения люминесцентные методы по чувствительности существенно превосходят спектрофотомегрические, поскольку при этом измеряется а с б олютная интенсивность испускаемого света, в то время как прн спектрофотометрии определяется уменьшение интенсивности пучка света в ре зультате прохождения через исследуемый образец, которое при низких концентрациях нагл ощающего вещества является малой разностью больших величин. Наиболее широко распространены флуорилгетринесхие жетоды, основанные на измерении флу р ф о есценции.
При поглощении ультрафиолетового или вндимога излучения молекулы лекулы переходят в электронно-возбужденное состояние. Полученная энергия может полностью переходить в энергию теплового движения, а может с определенной вероятностью (квантовым выходом) испускаться в виде рассеянного электромагнитного излучения, как правило, с частотой, меньшей частоты возбуждающего излучения. Это рассеянное излучение называют флуоресценцией. Его интенсивность можно измерить с высокой чувствительностью в любом направлении, даже отличающемся от направления пучка возбуждающего излучения, лучше всего в перпендикулярном ему направлении.
При использовании достаточно чувствительных фотоэлектронных умножителе ре й зто позволяет регистрировать концентрации флуорофоров, практически недоступные спектрофотометрическому методу. Для веществ с достаточно высоким квантовым выходом флуоресценции удается регистрировать концентрации флуорафор р д "" а по я ка 102е Мв ниже. Использование флуорометрических методов ограничивается тем, что далеко не все поглощающие ультрафиолетовое излучение вещества являются достаточно эффективными флуорофорами. Тем не менее среди них находятся такие аминокислоты, как триптофан и тирозин, в результате чего флуоресцируют все содержащие их белки.
При облучении светом длиной волны 280 нм, т.е. в максимуме поглощения остатков триптофана, наблюдается флуоресценция с максимумоМ испускания при 348 нм. па, в С . ф фо ом является восстановленное никат д ннами иое кольна, ильным пуаро р ией обладает АРАОН, у которого макси у ие д, ми Р езультате чего интенсивной флуоресценцие д нно п и 3 н 340 поглощения н максимум испускания находятся соответствен р 3 450 нм.
юшик Широко используется в аналитических целях введение флуоресцируюшя групп в различные мономеры и биополимеры. Например, остатки цитознна в аденина в составе нуклеиновых кислот и нуклеотидов могут р р быть п ев ащены е интенсивно флуоресцирующие зтенопроизводные обработкой хлор- и бромап~ виде тальдегидом по реакции, которая в случае аденина может быть записана в Аминокислоты могут быть превращены во флуоресцирующие производные обра- боткой офталевым альдегидом в присутствии меркаптоэтанола по реакции НО С~2СН20~ +ЗЗ42СНсгСООН ~ ~ М СНПСООм +222 О (О1 д) ОНО Это превращение используют в настоящее время при анализе аминокислотного состава белков вместо описанной выше обработки нингидрином.
В некоторых системах непускание происходит в результате образования молекул продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии. Примером такой реакции, нашедшей практическое применение при биохимическом анализе, является катвлизируемое пероксидазой окисление люлгинола пероксидом водорода по реакции О 11 + Нг+ йи (ЧП.4) ~С НН2 0 11 НН НгОг пероксидаз а ННг 3-ам и кофт злат люминал такое свечение называют хелгилюживесценцией. Наконец, известны отдельные процессы испускания света, происходящие в живых организмах — светящихся бактериях и светляках. Это явление называют биолюлгинесценцией.
Примером такой реакции является катализируемое люцифеРазой из светляков окисление люцифериладенилата (8) 1см. 3 2.1). Поскольку образование люцифериладенилата требует участия АТФ, интенсивность свечения связана с количеством АТФ в образце. Это открывает возможность измерять количество АТФ в образце по уровню биолюминесцеиции с исключительно высокой чувствительностью (до 10гм моль). Важной характеристикой методов дегекцни является их селективность, Больиие возможности повышения селективности описанных выше методов открывает использование ферментативных реакций.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
