Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 69
Текст из файла (страница 69)
В результате репликации появляются две новые копии с выбранными праймерами на 5'-концах. Процесс может быть продолжен, для чего необходимо расплавить сформировавшийся дуплекс и добавить новую порцию праймера, если он исчерпался. Последующее снижение температуры до уровня, позволяющего образование дуплекса матрица — праймер, позволяет осуществить следующий цикл реплнкации. Легко подсчитать, что теоретически достаточно 20 циклов, чтобы достичь увеличения количества ДНК в 10е раз, Так как ДНК-полимераза при нагревании может инактивироватьсл, то предпочтительно использовать специальные ферменты из термофильных организмов.
В настоящее время наиболее широко применяется ДНК-полимераза из 2негтиз айпайсиз (Тац-полимераза). В этом случае фермент выдерживает нагревание вплоть до температуры плавления и нет необходимости добавлять новые порции фермента после каждого цикла амплификацни.
Описанную процедуру называют цепной пази.иеразной реакцией или сокращенно ПЦР (от англ. ро1уиегаае сна1в геась1ов-РСН). Она позволяет повысить в миллионы раз чувствительность, открывая таким образом возможность детектирования небольшого числа полинуклеотидных цепей, например несколько частиц вируса СПИДа в исследуемой крови. Гибридизационный анализ образцов, предварительно амплифицированных с помощью ПЦР, открывает перспективу ранней пренатальной диагностики наличия дефектного гена у плода, используя в качестве анализируемого материала небольшое число клеток околоплодной жидкости. На рис.
74 представлена принципиальная схема нескольких первых стадий процесса амплификации. Аналогичным образом можно анализировать РНК, если предварительно провести обратную транскрипцию. Наиболее простым способом гибридизации является проведение ее с образцом, нанесенным в виде пятна на некоторую подложку (дат-~ибридизачия, от англ.
дое — пятно). Этот тип гибридизации фактически уже описывался на примере анализа на содержание гена энтеротоксина. Разрешающая сила метода повышается, если анализируемый образец предварительно подвергнуть гель-электрофорезу. В этом случае полезно перенести материал с геля на более удобный длл проведения г"бридизации материал, приведя гель в контакт с целлюлозным или нейлоновым Фильтром. Добавление меченых зондов позволяет обнаружить полосы, несущие определлемые последовательности. Этот метод известен как еибридизачия па Саузерну. Одним из широко используемых применений гибридизации по Саузерну является метод, известный под названием НРСР (Неаг11сс1ов Рганвевь Сеанса Ро1уиогРа1зв). В этом методе анализируемый образец дНК подвергается обработке спеЦнфнческими эидонуклеазами рестрикции (см.
3' 7,8), которые разрезают иссле- 3' ДНК вв туг»ива вягэаяаижи ~ вэывир е ДНК ПОаамяэяяа пФбэвжаааш 3' 5'и 3 5! 3' 5'П 5 3' 5' 3 5! 3' 3 5'П ° 6 3' 5'П ° 5 3 5' 3 3' ~~~~1П 5'О ° 6' 6'0 а 5 3' 5'и 3' 5' ° 5' 3 ° 5' дик 3' ° 5' днк 3' ° 5 днк 3' ° 5' ДНК 3' ° 5' днк 3' 3' 5 3' 3' 5' э' 5'о 3 ЭО аахяяа 13 10' О»Я»ОГО Рнс. 74. Прннппппяяьпяя схем» первых ет»пий п1юпееея»юппфппяппи дуемую ДНК по определенным точкам. После электрофореза и Саузерн-гибридизации получается характерное расположение полос, гибрндизующихся с некоторым определенным зондом. Это расположение строго индивидуально для каждой дНК, поскольку прн изменении в какой-либо точке последовательности, узнаваемой соответствующей эндонуклеазой, размеры некоторых из фрагментов, а следовательно, и расположение полос изменяются.
Это может быть использовано для идентификации людей в криминальных ситуациях, по оставленным ничтожным следам какого-либо биологического материала. Метод также полезен для выявления патологических генных мутаций. Следует отметить, что в случаях, не требующих сверхвысокой чувствительности, ПЦР может быть использована для того, чтобы определять наличие определенных нуклеотидных последовательностей в образце без последующей гибридизации. Появление полосы определенной длины в полиакриламидном геле при злектрофорезе после того, как образец был подвергнут ПЦР с определенной парой праймеров, надежно указывает на то, что выбранная последовательность действительно присутствует в образце. Значение ПЦР не ограничивается ее применением в гибридизационном анализе.
Ц можно использовать и в препаративных целях для накопления достаточного количества материала ддя различных научных н прикладных задач например для получения достаточного количества ДНК-зондов. 7.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОИ МАССЫ ВИОПОЛИМЕРА Существенный этап в исследовании биополимеров — определение их молек— у лярной массы. В отличие от химии высокомолекулярных соединений, имеющей в основном дело с полидисперсными системами и поэтому оперирующей со средними значениями молекулярных масс, биохимию в части, касающейся белков н нуклеиновых кислот, в первую очередь интересует молекулярнан масса индивидуальных объектов. Очевидно, что наиболее точным методом определения молекулярной массы индивидуального белка или нуклеиновой кислоты является установление их первичной структуры, после чего молекулярную массу получают простым суммированием ее значений для отдельных мономерных звеньев.
Поскольку на сегодняшнем уровне биохимии установление первичной структуры практически всегда является одной из основных целей исчерпывающего изучения бнополимера остальные методы определения молекулярной массы применяются в основном на пРомежуточных этапах исследования, а также в тех случаях, когда биополимер не удается получить в виде индивидуального, пригодного для детальных структурных исследований вещества.
В этом параграфе речь будет идти именно о таких пРиближенных методах, используемых на первой фазе изучения биополимера. На ранних этапах развития биохимии белков н нуклеиновых кислот важное значение имели абсолютные методы определения молекулярной массы, т,е. методы, не привлекающие данных, полученных на других аналогичных объектах. В Настоящее время, когда в распоряжении исследователей имеется огромный материал по молекулярным массам самых разнообразных белков и нуклеиновых кислот, шн роков применение нашли относительные методы, основанные на сопоставлении каких-либо легко доступных измерению зависящих от молекулярной масй 265 — ~ У ® ННЙ НЙ е — Р— е — Р— е — м — е — о во ! ! о -о -е 0 (в) 0 — Р— Ом .О. ! 0 Ы мом ммммотмо м ама + Ннэснй~СО НнснйосΠΠ— — РС"-О О !! (! 0 о + "0 — Р— Π— Р— 0 — Або о о Н!СН ! 307ННСНЙ1СО ННСНЙэсО + + нн снй соо +...
Гммец о м му ВОоННСНЙ, СОО" О Я„ инэв сы характеристик исследуемого объекта с данными для биополимеров с уже известной молекулярной массой. Среди абсолютных методов удобным и в ряде случаев несложным является метод коизеооьо аиалиэа. Как в белках, так и в нуклеиновых кислотах на концах имеются группы, существенно отличающиеся по свопы свойствам от соответствуюш;нх групп внутренних остатков. Если провести по одной из этих групп химическое или биохимическое (т.е. катацизированное каким-либо ферментом) превращение, позволяющее количественно ввести в нее некоторую метку — спектральную, флуоресцентную или радиоактивную, то тем самым можно определить число концевых групп, т.е. число молекул биополимера в образце.
Зная одновременную массу исследуемого образца, нетрудно отсюда найти молекулярную массу, В белках для концевого анализа используют динитрофенильную группу, которую вводят по уникальной концевой а-аминогруппе обработкой динитрофторбензолом. Введенная метка устойчива в условиях полного расщепления белка до аминокислот.
Лишенная положительно заряженной в кислой и нейтральной среде ааминогруппы динитрофениламинокислота может быть легко отделена от остальных а-аминокислот, образовавшихся при гидролизе полипептидной цепи, а ее количество может быть измерено по характерному для динитрофенильных производных УФ-поглощению при ЗбО нм.
Аналогично может быть использована реакция с 5-М,Х-диметиламинонафталин-1-сульфоннлхлоридом (сокращенно дав. силхлоридо.а), приводящая к превращению концевой аминокислоты в дансильное производное, которое может быть с высокой чувствительностью зарегистрировано по характерной флуоресценции при облучении УФ-светом с 1 = 254 нм: н(сн ! Для рибонуклеиновых кислот характерной является иис-диольиая группа на 3'-конце олиго- или полинуклеотида. Добавление периодата натрия приводит к окислению ее до двух альдегидных групп, а последующее взаимодействие с аминами — к образованию оснований Шиффа. Последние могут быть восстановлены до стабильных алкиламинов с помощью боргидрида натрия. Все реакции праге. кают в водном растворе при комнатной температуре и нейтральном РН, т.е. в условиях сохранности полирибонуклеотидной цепи, Последовательность превращений может быть записана в виде где  — любой гетероциил.
Если радикал а содержит спектроскопическую, поглощающую вне области поглощения РНК (т.е. при л > 300 нм), флуоресцирующую или радиактивную метку, то процедура позволяет определить молярную концентрацию концевых групп, т.е, общее число молекул РНК, а следовательно, и молекулярную массу. Для ДНК концевая метка может быть введена ферментативным путем. Чаще всего для этой цели используют фермент аолинуклеотидкииаэу, специфически катализирующую перенос остатка фосфорной кислоты от молекулы АТФ к 5'- гидроксигруппе 5'-концевого фрагмента ДНК. Этот фрагмент производится в Е.со!о, зараженной бактериофагом Т4, который содержит ген, программирующий синтез этого фермента.
Если исходная ДНК содержит в 5'-положении остаток фосфорной кислоты, то его можно предварительно удалить с помощью другого фермента — фосфоаоиозстераэм (щелочной фосфатазы), катализирующей отщепление ортофосфата от моноэфиров фосфорной кислоты. Чаще всего для этой цели используется фермент из Е.со!С В целом схему введения 5'-концевой метки в ДНК можно представить следующим образом: (здесь Р* — радиоактивная метка, ээР или эвР). Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение.
Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментацин биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и "змерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центриФужиой ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстоя""лх т от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного 'бьема, или, что то же самое, плавучей плотности биополнмера в условиях, используемых для седиментации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
