Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Наиболее употребительные относительные методы основаны на измерении подвижности ижности биополимеров в какой-либо системе зонального фракционирования. Для нативных белков используется гель-хроматография. Из-за гетерогенности пор в таких гелях в д в достаточно широком диапазоне молекулярных масс объем У в котором выходит биополимер, возрастает с уменьшением молекулярной массы М, поскольку возрастаег число пор, доступных для биополимера. При этом достаточно хорошо выполняется зависимость (7.6) 1ЦУо = А — В1КМ, где Уе — внешний (свободный) объем геля; А и  — постоянные коэффициенты, Проведя на колонке с гелем измерение Ус для нескольких белков с известной молекулярной массой, т.е.
фактически осуществив градуировку колонки, можно определить Ус для исследуемого биополимера и путем интерполяции с помощью соотношения (7.6) найти его молекулярную массу. Существенно, что гель-хроматографию можно проводить в мягких условиях, сохраняя белок в нативном, функционально активном состоянии. Если в распоряжении экспериментатора имеется специфический тест на этот белок, пригодный для его выявления в смеси с другими белками, например определенная ферментативная активность, то определить молекулярную массу можно даже в неочищенном препарате белка, т.е. уже на промежуточных стадиях его очистки.
Если полимер имеет четвертичную структуру, то, как р правило она сохраняется в условиях разделения н молекулярная масса представляет собой сумму масс составляющих белок субъединиц. В качестве метода разделения для той же цели широко используют электрофорез в гелях. Для белков вследствие различий в нх аминокислотном составе простой корреляции между молекулярной массой н подвижностью в электрофорезе не существует. Однако она может быть получена, если вести электрофорез в присутствии детергента.
В биохимической практике для этой цели чаще всего используют додецилсульфат натрия С1эНтзОЯОзйа (зосПви донесу звПа е, сокращенно Яэ). При разделении в Бйэ-полиакрнламидном геле происходит полная денатурация белковых молекул с выворачиванием наружу их гидрофобного ядра в результате захвата додецильных радикалов, в результате чего на поверхности образовавшегося агрегата появляется отрицательный заряд и д и он ве ет себя в электрофорезе как полианион. Эксперимент показывает, что при этом в широком диапазоне выполняется линейная зависимость электрофоретической подвижности от логарифма молекулярной массы, которая после градуировки по белкам с нз" вестной молекулярной массой может быть использована для определения молекулярной массы исследуемого биополимера. В результате денатурации субъединичные белки диссоциируют на отдельные субъединицы, так что, во-первых, выявляется, из скольких разнотипных субъединиц состоит исследуемый белок, н, во вторых, находится масса отдельных субъединнц.
Электрофорез в полиакриламидном геле также используется для ц о енки молви лярной массы нуклеиновых кислот. Применительно к таким огромным молеку Ку лам, каковыми являются даже простейшие ДИК, например Д крупных вирусов или митохондриальные ДНК, этот подход мало эффективен, вс ДНН нз он широк при о применяется для оценки размеров фрагментов двунитевых Д ию пе внчве" которые их разрезают на первых этапах работы по установлению первнчв структуры. Этот вопрос несколько подробнее рассмотрен в ",' ",' 7,8.
С 7.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОВ СТРУНТУРЫ ВЕПРОВ Белки и нуклеиновые кислоты при всем их неисчерпаемом многообразии построены из стандартных наборов соответствующих мономеров. Поэтому установ- ление первичной структуры сводится преимущественно к выяснению, в каком порядке эти мономеры располагаются вдоль полипептидной или полинуклеотид- иой цепи. Эту задачу часто называют секвенирееаяиеж (от англ. зейвевсе — по- следовательность). В отдельных случаях, естественно, исследователи сталкиваются с тем, что в составе исследуемого биополимера оказываются минорные компоненты неизвест- ного строения.
В этом случае встает задача выделения этих компонентов и уста- «овления их строения методами органической химии, причем нередко приходит- ся ограничиваться незначительным количеством материала, исключающим на первых порах применение таких высокоинформативных методов структурного , анализа, как ядерный магнитный резонанс и рентгеноструктурный анализ. При последующем изложении будут рассматриваться методы, основанные на предпо- ложении, что подобные компоненты в секвенируемом биополимере отсутствуют.
Собственно секвеннрование на его сегодняшнем уровне позволяет определить последовательность аминокислот в полипептидах, состоящих не более чем из нескольких десятков аминокнслотных остатков, и определить в один прием по- следовательность для полинуклеотида, длина которого не превышает нескольких сотен мономеров. Существенно, что названные полимерные фрагменты значитель- но короче, чем те природные биополимерные молекулы, структура которых под- лежит определению. Поэтому перед собственно процедурой секвенирования при- ходится разрезать исследуемый полимер на фрагменты определенной длины, достаточно короткие, чтобы их можно было подвергнуть секвенированию, Обыч- но речь идет о разрезании на значительное число фрагментов, которые должны быть разделены и очищены до индивидуального состояния.
После того как каж- дый из них подвергнут секвенированню, следует восстановить структуру исходно- го биополимера, т.е, определить, в каком порядке набор фрагментов с уже уста- новленной первичной структурой располагался в исходном биополимере. Таким образом, определение последовательности мономерных фрагментов в бнополимере разбивается на три главных этапа: ~) ) расщепление биополимера на несколько фрагментов, имеющих длину, дос- тупную для используемых методов определения первичной структуры, и выделе- ние этих фрагментов; 2) секвенирование каждого из полученных фрагментов; 3) сборка полной структуры биополимера из установленных структур его ФРагментов. Ниже последовательно рассматриваются важнейшие из используемых для этой цели подходов.
Для специфического расщепления белков по определенным точкам применя- ются как ферментативные, так и химические методы, Из ферментов, катализиру- Юьдн щнх гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипснн и химотрипсин. Трипсин специфично катализирует гидролиз пептидных ~вязей, е-, расположенных после положительно заряженных аминокислотных остат- ков— — лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки восле сле остатков ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина и трипто- а н,с,„~~ йй — СН вЂ” Сов 1Сн,1, йй; ! йн — ~н — со 1сн, 1, ! йН ! СΠ— СН =С вЂ” СООН сне -МН вЂ” СН вЂ” СО ,! 1И1. 111 'МН, СОО! СО-СН=С Сн, Наоборот, обработка исследуемого белка зтиленимином приводит к модификации в ием остатков цистеина по реакции + НООС вЂ” СН = С вЂ” СООН сн МН вЂ” СН вЂ” СО МН вЂ” СН вЂ” СО ! пн сн, „с~ ~ и, Снг !ищ 5Н 5 — Снэснт-Мн~ в результате которой на этих остатках возникает положительно заряженная группа.
Трипсин катализирует расщепление пептидных связей по заряженным аминозтилцистеиновым остаткам. Наряду с ферментативными методами в практику белковой химии широко вошли химические методы расщепления по амннокислотным остаткам определенного типа. Среди них важнейшим является расщепление с помощью бромциана, которое проходит по остаткам метионина по схеме МН вЂ” СН вЂ” СΠ— МН вЂ” СНМ вЂ” СО ! сн, 1Н, ! 5СН МН вЂ” СН вЂ” СΠ— МН вЂ” СНМ вЂ” СО ! СН2 ! СН, й— = С 5 НЗ в сп -Вг -сн,эсп вН фана. Механизм действия этих двух ферментов и факторы, обеспечивающие указанную специфичность гидролиза, вкратце рассмотрены в 5 6.1. В ряде случаев, особенно когда этих двух ферментов по тем или иным причинам оказывается недостаточно, привлекаются и другие протеазы. В необходимых случаях специ фичность трипсина может быть повышена или изменена.
Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина, которые в результате этого теряют положительный заряд. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина, который при этой процедуре не модифицируется. Применение цитраконового ангидрида для ацилнрования позволяет в дальнейшем, после раздел~ ния полученных полипептидов, отщепить цитраконовую кислоту мягким кислотным гидролизом. Этому способствует наличие вблизи образовавшейся амидно» связи карбоксильной группы, способствующей легкому внутримолекулярному протонированню амидной группы, которое резко облегчает атаку амидной связи водой: 3 МН вЂ” СН вЂ” С + МН -СНЯ вЂ” СО Н2О l СН О сн О ,с, ГЬ вЂ” й ~НП,+ МН СНЯ СО С йН 5' В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты йь который может быть идентифицирован путем измерения какой- либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
