Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Следует рассмотреть два основных огучая. Первый — это определение присутствия и количества фермента по его Ферментативной активности, например его содержания во фракциях по ходу зиделення. Очевидно, что регистрация ферментативнай активности в некоторых ФРакциях дает существенно более значимую информацию, чем простое определе""е присутствия белка, даже если обнаруживаемый фермент обладает специфичес ескнми особенностями, например является флавопротеином с характерным для цигавиновых нуклеотидов спектром поглощения. Такое поглощение будет наблюззться и в случае смеси нескольких флавопротеинов с разными биологическими 'гувкциями. В большом же числе случаев фермент состоит только из белка и по езов овм спектральным характеристикам существенно не отличается от других белов, находящихся в этом же самом материале.
Таким обоазом. только способность ('вП.5) Н, ОН) + + Н202 (711.6) нвмврв Ееемои рис. 70. Хромягогряммя ядя греднеязнагскои гюРзы: 1 — конценгряцня белка (уФ-ооглокгенне прн 280 нм); 2 — янгнвнссгь фосфоднястерязы; 3 — вкгнв-б ность б-нуклеогндяяы (по денным Г.т. Бябкннан, С.к. Вяснленко) катализировать определенную ферментативную реакцию может служить доказательством присутствия фермента в анализируемом образце.
Естественно, этот критерий необходимо использовать с осторожностью, так как в образце может присутствовать ряд ингибиторов или могут отсутствовать активаторы, необходимые для проявления ферментативной активности. В этом случае необходимо искать дополнительные тесты. Существенным преимуществом определения ферментативной активности является чувствительность этого метода, так как каждая молекула фермента способна превратить в продукты тысячи и даже миллионЫ молекул субстрата. Например, в начале этого параграфа показано, что в кювеве объемом 1 ммв можно зарегистрировать 10 '2 моль МАО Н.
Таким образом исследуемый фермент, если он катализирует окисление определенного органическоЮ вещества с помощью НАО' с каталитической константой порядка 102 с ', за полч* са (т.е. за 1800 с) способен накопить необходимое количество НАО.Н при наличи" порядка 10 'в моль фермента в образце. Для фермента с молекулярной массой 10» это означает возможность регистрации 10'в, или 0,1 пкг, фермента. В качестве примера на рис. 70 представлен профиль элюции ионообменной хроматографии змеиного яда из кврега 1сЬегвва (гюрзы).
Как и все змеины ые яды, он представляет собой сложную смесь белков. Профиль элюции белка полу' чали измеряя оптическую плотность при 280 нм, характерную для белков, та" 254 как триптофановые остатки являются основными фрагментами, отвечающими за УФ-поглощение. Параллельно измерялась активность двух ферментов во фракпиях. Активность фосфодиэстеразы змеиного яда, катализирующей отще ление 3 -концевых нуклеотидов от нуклеиновых кислот, определялась по количеству окрашенного в желтый цвет я-нитрофенолята, опцспившегося от Са-бис и-нитрофенилфосфата, который является субстратом фосфодиэстеразы.
Другой фермент, 5'-нуклеотидаза, катализируя отщеплепие неорганического фосфата от та от нуклеоэид 5'-фосфатов, приводит к накоплению фосфата, количество которого легко определяется по интенсивности сине-фиолетового окрашивания, возникающего при добавлении раствора молибдата аммония в 5 н. серной кислоте. С другой стороны, ферменты открывают возможность анализировать с высоким уровнем специфичности присутствие определенных соединений в биологических образцах.
В специальных книгах, посвященных проблемам медицинской биохимии, можно найти ряд важных биохимических критериев необхо , нео ходимых для диагностических целей, в первую очередь анализов крови. В качестве примера можно привести фермеитативное определение глюкозы. Содержание глюкозы в крови является важным показателем состояния организма, особенно в случае диабета.
Основная задача заключается в том, чтобы отличить глюкозу от других моносахаридов и превратить се в производное, легко определяемое фотометрическн. Одне из наиболее Распространенных систем состоит из двух ферментов: глюкоэооксндазы и пероксидазы йз хрена. Первый, будучи флавопротеином, кателиэирует превращение глюкозы в глюкоиолактон: ОН НО ОН Наличие Н 0 м 2 2 ожйо легко регистрировать с помощью катализируемой пероксидазой реакции с некоторыми органическими веществами, которые, окисляясь Н20и дают окрашенные продукты.
Например, в качестве субстрата пероксидазы широко используется смесь 4-аминоантипирина и фенола, которые образуют оранжево окрашенный аддукт (99): 2 з "2 О.. ГН-0Нв ~ ~ Н + Н20г— СеНв Н + 2Н20 О~ 99 0,Н, 54ожно также о хе пределять содержание пероксида водорода по мнлюминес ен и до ц ц и~ возникающей в Результате описанной выше реак и бавлеиии люминола. В этих случаях, очевидно, не происходит увеличение количества конечноге детектируемого вещества или аддукта и чувствительность метода не превышае традиционные методы.
В то же время использование фермента, строго специфич ного для ~3-0-глюкозы, делает определение весьма селективным. В заключение следует сказать, что сейчас активно развивается новая облает биохимического анализа — трансформация результатов биохимического процесс в физический ответ с помощью соответствующих специальных устройств. Подай ные устройства называют аиасекеаралти. Например, ответом на определеннее биохимическое событие может быть изменение потенциала некоторого электрода Так, углеродный электрод, покрытый пероксидаэой, может посылать электроны к НтОь который восстанавливается в соответствии с уравнением Н От + 2е + 2Н' 9 2Нт0 Процесс сопровождается существенным изменением потенциала, которое легко можно измерить и соотнести с концентрацией НтОт.
Следовательно, если подобный электрод обработать и глюкозооксидазой и пероксидазой вместе, то он будет <отвечать> на присутствие глюкозы, так как последняя будет окисляться кислородом, давая НтОт в соответствии с уравнением (17.3). Возможно использование и других типов физических ответов Например, для реакций, сопровождающихся образованием или Расходованием От, могут быть сконструированы оптические биосенсоры. В качестве примера такого сенсора может служить концевая часть оптического волокна, покрытая двойной пленкой, состоящей из флуоресцирующего порфиринового красителя, заплавленного в полистирол, и соответствующей оксидазы, например глюкозооксндазы. По оптическому волокну к исследуемому образцу, в который погружен биосенсор, подводится возбуждающее излучение и по нему же отводится к флуориметру испускаемое излучение.
Интенсивность флуоресценции порфирина понижается в присутствии Оъ и таким образом, может быть соотнесена с концентрацией О. в слое, находящемся в непосредственном контакте с биосенсором. Расход От, обусловленкы й присутствием окисляемого соединения, приводит к уменьшению концентрации О в слое, прилегающем к пленке, содержащей порфирии, воздействуя таким образом на интенсивность флуоресценции. 7.4. ИММУНОАНАЛИЗ Иммуноглобулины из-за своей поразительной специфичности стали исключительно важным инструментом биохимического анализа. Методы, основанные е ка образовании комплексов антител с антигенами или гаптенами, называют иат.иу ноаналиэа.и.
Иммуноанализ используется либо для определения определе енкых антигенов с помощью специфических к этим антигенам антител, либо, нас Р обо ог, дчтя детекции антител определенной специфичности с помощью соответствуютд Ютцвх антигенов. И та, и другая задача имеет широкий спектр применений в фундаме" тальных биохимических исследованиях, в биотехнологии, в медицинской пр актике и для оценки состояния окружающей среды. Выявление присутствия определенных антител в живом организме имеет Р т прав нтитед " де всего значение для решения ряда медицинских задач. Присутствие анти ваэ9зин определенным вирусам нли микроорганизмам и их количество являются ваэ9 критерием наличия или, наоборот, отсутствия у организма иммунитета к соотка9 256 Й твующим заболеваниям, свидетельствует о присутс исутствии в организме соответствутощего возбудителя заболевания.
Например, наличие аличие в сыворотке крови некоторых людей антител к возбудителю СПИДа, вирусу ВИЧ-1 —, указывает на заражекне человека приобретенным синдромом иммунодеф оде„ицита, что является первым сигналом об инфицировании данного человека з века задолго до того, как появятся клинические симптомы СПИДа. Чрезвычайно широкий спектр применений и ест и имеет иммуноанализ для определеаня как самого факта присутствия, так и изме е мерения количества антигенов, в том числе гаптенов, т.е.
низкомолекулярных соеди й динени, к которым можно получить антитела, как правило, п м им уте муниэации животных конъюгатом гантэна с высокомолекулярным носителем, способным ным вызывать иммунный ответ. Иммуноаналиэ нашел широкое применение для ан анализа содержания различных тормозов, что имеет огромное значение для оцен енки состояния эндокринной системы человека и животных. Важное значение для для оценки состояния окружающей среды, в первую очередь качества питьевой воды и пищевых кммуноаналиэ содержания пестицидов. В св евых продуктов, приоб тает евых, ре ов.
связи с интенсивным развитием гибридомной техники для анализа оп ределенных антигенов все более широкое приме- кение находят моноклональные антитела. ал Во всех случаях иммуноанализа первичной задачей явл ан изируемого объекта в комплекс антиген— является превращение чества. П и ген — антнтело с определением его количества.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
