Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 68
Текст из файла (страница 68)
71 представлены результаты подобн д бного анализа во время развития инфаркта. В этом случае отчетливо наблюлачн анись две стадии развития болезни. 7.5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ П4БРИДИЗАЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Подобно тому, как в иммунохнмических методах наличие определенною анти- гена в анализируемом образце определяется по взаимодействию с антителом, специфичным к этому аятигену, присутствие в образце, содержащем нуклеиновые кислоты, определенной нуклеотидной последовательности может быть зарегисз рировано с помощью олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты, комплемеитарных анализируемой последовательности, путем (51 а(-.ртрсрбрбрсрт...) РЛ Рб а(...рдрерсрсрбрд...) (5') регистрации обраэовывания дуплекса Соответствующие иуклеиновые кислоты или олигонуклеоти- !! 1 ды обычно называют олигонухлеогпидны.ии зонда.ии Рб а(...ртрсре[рбрсрт...) [31 или полинуклеотидными зондами (ДЛК-зонды или Р1 а[...рдрбрсрсрбрд...) [г) РИК-зонды).
Метод анализа, основанный на гиб! 3' ридизации с такици зондами, называют гибридиза; l чванным анализолп Анализируемый образец может [г) а(...рт рсрб рсрт...) (31 быть закрепле! на какой-либо подложке или Р) а(- Рдрбрсрсрбр* .) РЛ иммобилизован в геле. Последняя ситуация до!31 вольно типична для нуклеиновых кислот, если (51 а(-ртрсобрб)рсо 5...) (т) анализируемая смесь подвергалась гель-электро- Р'! а(-одрбрсособрд-.) (г) форезу. Нммобилизованный образец может быть гНт обработан соответствующим зондом, несущим какую-нибудь метку, которая после удаления избытка зонда позволяет с высокой чувствительностью зарегистрировать образование дуплекса.
г1» Олигонуклеотидные зонды получают синтетически Р) а(-ртрсобрбрс)рт-.) (3) (см. 3 7.10). днк-зонды могут быть получены с РЛ а(- рарбоСРСрб РД-) (5') помощью генетическОй инжЕНЕРии с использованиРиг. 72 1 чг мя выд нпя рядиг- ем методов, описываемых в 3 7.11. Одним из наияктивнпп чьетки ~ помпшьн~ ни! — более эффективных путей является введение т(шн"""инш -(ве ве(чтг!ья»! "нг»' комплементарного дНК-фрагмента в бактериофаг, не!гты обпзнянянчт рязрыв г обрязовянпгм 3'-01! и 5 ' шшш содержащий одноцепочечную ДНК, например ваго г(шгфятя (нпь ): мутантный бактериофаг М13, несущий требуемую 'б(яь""щни' """" д"н""'" вставку. Путем размножения такого фага в клетНнязы 1: ' — ьышепчение рм под Л~ю "и ' о к,„хозяина можно н,копить его в значите,ьном деигтьием Д!1К-почимергоы 1: 3— зяетооикя бреши о диояктияным количестве.
Если для детекции предполагается ф( г». ~ентг ь р ' н; г помошьш использовать радиоактивные зонды, то их дпн-г~ояпц»1»,зы 1 и ОРО бс: 5 — НЕГрудНО .ЮЛуЧИтЬ раЗМНОжЕНИЕМ фаГа В СрЕдв, выщепченпе счел 'ош"го (Р ! содержшцей [ззр)-ортофосфат. ф(шгментя: 3 — »кт(шикя брмпи г поькяиыа Ими бС Методы генной инженерии позволяют ввести ДНК-зонд в виде соответствующего двунитевого фрагмента в плазмиду.
Этн плазмиды после размножения внутри бактеризльных клеток можно использовать непосредственно в качестве зондов, так как, будучи расплавлены, такие плазмиды не полностью ренатурируют и содержат требуемые однонитевые фрагменты. Их также можно <вырезатьз из плазмиды, используя специфические ферменты рестрикции (см. 3 7.6), и пометить, используя различные химические и биохимические методы. Одним из наиболее распространенных методов для подобных целей является нин-пгрансляг)ия, позволяющая ввести как высокорадиоактивные метки, так и метки для нерадиоактивного анализа.
На рис. 72 представлена схема радиоактивного мечения двунитевой ДНК с помощью ник-трансляцни. Двуцепочечная немеченая ДНК, одна из цепей которой должна служить зондом, обрабатывается ферментом ДНКазой 1, которая вызывает разрывы в дуплексной структуре с образованием 3'-ОН-группы на одном конце разрыва и 5'-фосфат — на другом конце. Такие разрывы называют никами. Затем такая ДНК обрабатывается ДНК- полимеразой 1 из ЕзсАеггсАга сой в присутствии одного или всех четырех [о-ззР]- дезоксинуклеозид-5'-грифосфатов.
Из-за присущей ферменту 5'-3'-экзенуклеазной активности (см. 3 5.4) фермент последовательно отщепляет 5'-концевые нуклеотиды в точках разрывов, а образующаяся брешь немедленно застраивается в результате ДНК вЂ” полимеразной активности. При этом радиоактивные нуклеотидные остатки присоединяются по 3'-0Н-группам бреши. Многократное повторение подобных событий приводит к замещению значительной части нерздиоактивных остатков радиоактивными, давая таким образом высокомеченый зонд. Ники в ходе этой операции сохраняются, но могут быть легко устранены с помощью ДНК-лигазы. РНК-зонды с высокой радиоактивностью могут быть получены путем транскрипции соответствующей двунитевой ДНК в присутствии меченых в а-положении рибонуклеозид 5 '-фосфатов.
Как и в иммуноанализе, в гибридизационном анализе в настоящее время интенсивно развиваются подходы к нервдиохимической детекции, в первую очередь на основе использования ферментов. С этой целью можно либо использовать зонды, содержащие ковзлентно присоединенный фермент, либо ввести в зонд какие-либо группы, способные взаимодействовать с вспомогательным белком, конъюгированным с ферментом.
Существует ряд методов, позволяющих ковалеитно связать фермент с олигонуклеотидным зондом. В качестве примера можно рассмотреть получение конъюгата олнгонуклеотида-эонда с щелочной фосфатазой из кишечника теленка, уже упоминавшейся при описании иммуноферментного анализа. Из олигонуклеотида нетрудно получить производное оли гонунлеотид —.Р— (О) (О ) — НН(СНг) гННС(0) (СНг) г3Н с 3 -концевой 3Н-группой. В щелочную фосфатазу можно ввести некоторое число бромацегильных остатков путем ацилирования части б-аминогрупп боковых радикалов лизина актнвированным производным бромуксусной кислоты, например ее ангидридом. Алкилирование 3Н-группы зонда бромацетильным остатком фермента приводит к конъюгату: олигонуклеотид (0)(0-) ХН(003)з((Н вЂ” С(0)(СНз)з 3 СН30(0) — фермент В качестве иллюстрации приценен ия гибридизационного ° о! оз оэ ол анализа с помощью такого ° ° ° »5 оа оз оа ° ° б конъюгата можно привести б результаты анализа серии бакте и Рис.
73. 1»тенпип методом мотекучярной гибридизяр альных штаммов на пии ияли чин в фекялияк пяпиентов патогенного штямспособность продуцировать мя Е гой негушего ген энте(чотгюьтинк: знтеиотокси н Роте!есин ПРи этом гг — нядпокнмп»е<кии янячип б — схем» нанесения обрязцов ка честве зондов использовали ~!-ш ч» гкв ь .. олигонуклеотиды, комплементарные к определенным областям бактериальной ДНК, кодирующей энтеротоксии. Образцы ДНК выделялись из бактериальных штаммов, которые предполагалось исследовать на содержание гена энтеротокснна, и иммобилиэовались на нитроцеллюлозных фильтрах. Те из них, которые содержали ген токсина, при обработке конъюгатом зонд-фермент гибридизовались с конъюгатом и могли быть легко идентифицированы путем добавления 5 Нг-4-С1-3-индолилфосфата по появлению на фильтре характерного скрашивания Полученные результаты как радиоактивного, так и ферментативного определе ния, представленные на рнс.
73, четко демонстрируют, что патогенный штамм присутствует в образцах, обозначенных номерами 2, 5, 7, 8. Для использования сэндвич-гибридизации в зонд нужно ввести спешаальные группы, обладающие высоким сродством к вспомогательному белку, несущему метку. Как и в иммуноферментном анализе, с этой целью часто используют биотин. Его легко присоединить к олигонуклеотидам или ввести в молекулу ДНК мягкой обработкой зонда. Например, небольшое число цитозиновых остатков можно превратить в производные, несущие алифатическую аминогруппу.
С этой целью зонд обрабатывается этилендиамииом или гексаметилендиамином в присутствии бисульфита натрия в соответствии с реакцией мн нн, нн(сн ) нн н П,игь) н, + н80— 0 0 1 н Н МН(СНз) Ян — СΠ— биотнн и нн(сн ) нн (зП.7) Последующая обработка М-гидроксисукцинимидным эфиром биотина приводит к образованию биотинилированной ДНК. При такой модификации у цитоэина сохраняется один М-н-фрагмент, способный к образованию уотсон-криковскнх пар с комплементарными гуанииами, хотя эта их способность существенно понижается. Тем не менее при низкой степени модификации и достаточно длиннои зонде гибридизационная способность остается высокой.
Биотинилированнуы ДНК в составе дуплекса, образованного зондом с мишенью, можно определить используя конъюгат стрептавидина с пероксидазой, фосфатазой или каким-либо другим ферментом, Наряду с ферментами в гибридизационном анализе нередко применяют введение в зонд каких-либо гаптенов, например динитрофенильных остатков. В зтои случае образовавшийся дуплекс можно зарегистрировать с помощью антител специфичных к гаптену и конъюгированных с ферментом.
252 Огромным достоинством гибридизационного анализа является возможность резко повысить его чувствительность, используя способность нуклеиновых кислот к самокопированию, приводящему к существенному увеличению числа анализируемых молекул. Этот прием известен под названием аипзифипачии. Если речь „дет об определении нуклеиновой кислоты известного строения, то содержание фрагмента этой ДНК длиной в несколько сотен пар нуклеотидов в исследуемом образце можно резко увеличить с помощью ДНК-полимераэы. С этой целью к образцу добавляют синтетические праймеры, комплементарные 3'-концам обеих нитей амплифицируемого участка ДНК, выбранных для репликации. В такой системе в присутствии дезоксинуклеозид-5'-трифосфзтов и ДНК-полимерзэы происходит репликация ДНК, причем именно той, для которой выбраны праймеры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
