Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 71
Текст из файла (страница 71)
В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой — либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра. Превращение Х-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е.
установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном для следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специааьные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — аатажатические секаепаторм полипептидоа.
С их помощью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации. Особенно удобно для автоматизации проведение ступенчатой деградации полипептида, ковалентно привязанного к нерастворимому полимерному носителю. В этом случае на всем протяжении секвенирования исследуемый образец остаегся 271 + МН вЂ” СН вЂ” С = МН вЂ” СНЯ вЂ” СО СН, О (2П. /Х) сн Секвенированне полипептидов проводят методом, известным как .аетод Эд.ив„а, Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую ааминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде (при значениях кислотности, не повреждающих пептидные связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина.
Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизотиоцнаната и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов: — йй, сня,сойнсня,сΠ— + гь-й=с=5 — пп — йн — с — йн-сня сойнсня СΠ— — 1"- 11 2 5 — — ОССННЕННСОСНЕНЕНВз ! й + ннд-Я ! О й Снз ~вид ! ) тОССНВВВНЗСОСВЗВндзнд нн-сн-сонеьу Ьнз 1 Снз Ьн ~~ ~~~-н.сез / н ° -в (~ ~~~~езн-с-ннснвесо в ! 1 Сиз $ Сид 1 ОН 1 СНВвз н-со-сн-нн -.со 1 СНд ОН 141 1 Е ~( '~~~~у' 'нн Рис. 75. Ечемя нтвердофязного>> секвепировяния полипептидз нз приме- ре фрагмента, полученного расщеплением бромцияном. Зачерненный кввдрат — полимерный носитель Основные стадии: 1 — присоединение пояипептидя к наситечю; " — пропускяние раствора фенияизотиоциянятз дпя присоединения к непуотаниравяннаи ачнминогруппе пептидя, 3 — промыв»я беизопом и прапускяние (»натворя 1»итГООН, п(зиводящее н отщеплекию фвниптивзопиив, содержащего бакавои Нядиквл ямикокислоты ц(1) и ткапаченныи нз одну яминокислоту пептид; 4 — пдомывкя и перевод фенинтиязояииз в фенилтиогидянтоин; б — кромятотдяфи ~ескии ияи мясс-спектрометрическии яннииз;б — возврат укороченного пептидя в повторение цикла процедур 2-5 в колонке, содержащей носитель, а через нее поочередно пропускают изотиоцианат и кислоту (например, СувСООЙ).
При этом исключаются какие-либо механические потери секвенируемого полипептида, чрезвычайно облегчается процедура отмывки образца от одного из компонентов перед пропусканием второго компо. пента. На рис. 75 представлена схема присоединения к полимерному носителю фрагментов, полученных расщеплением белка по остаткам метионина бромцианом, и последовательность операций, используемых для автоматического секвенирования.
Каждая стадия метода Эдмвна по своей идеологии полностью отвечаег канонам классической аналитической химии, согласно которым при невозможности идентифицировать и количественно определить вещество его следует количественно превратить в производное, поддающееся непосредственной идентификации. В данном случае на каждой стадии метода речь идет об определении природы И-концевого аминокислотного остатка. В составе полипептидной цепи это сделать ие удается и его отщепляют для последующего определения в виде тио- 272 н ':- с т' т- И 1 — 4с гидантоина. Попытки разработать аналогичные подходы для анализа полинунлеотидных ° И С цепей не увенчались значимыми успехами.
б — -- — — с $ Завершающим этапом установления пер- н~н вичной структуры является восстановление по- г рядка, в котором просеквенированные фрагРнс. 7б. Возможные варианты перекрывания пептидов. Т- менты Располагались в Пептиды получены расщеплением трипсином. С-хнмотрипсиисходном биополимере, ном Г Пептид содержит. чаше всего для этом а - соседние пептиды т и т, б пептид т и м-конец пептнда цели используют под- Т; в - пептид Т и О-конец пептидв Т; 1- С-конец пептидв Т н ход, который в белковой и-конец пептидв Т ' химии известен как .аепзод перекрываюц)игся блоков.
Ниже излагается 'основная идея метода, которая иллюстрируется на примере восстановления полной первичной структуры из фрагментов бычьей панкреатической рибонуклеазы. Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой Т вЂ” от слова <трипсиновые>, Сгурстс), то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с И- и С-конца.
В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С, с)1увоСгурС)с).
Как видно из рис. 76, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, которьзй либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С- концевую часть левого и 1т'-концевую часть правого пептида группы Т. Этот С-пептид перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода. Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т вЂ” пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или Разделены одним или несколькими другими Т-пептидами.
Неоднозначность может появиться только в случае, если перекрываемый каким-либо из С-пептидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность такого совпадения, как правило, невелика. Если зто все же происходит, приходится прибегнуть к еще одному варианту расщепления. В табл. 7.4 приведены структуры пептидов, полученных расщеплением рибонуклеазы с помощью трипсина и химотрипсина. Естественно, что, когда происхс»- дит разделение смеси пептидов трипсинового или химотрипсинового гидролиза- Т а б л и ц а 7.4. Структуры фрагментов, полученных при расвцеплеиии панкреатической . рибувюклвеэы крупного рогатоге скота трипсином (Т-фрагменты) и химотригкиием (Сфрагменты) ('( Химотрипсиновые пептиды Трипсиновые пептилы С-фрагмент Т-фрагмент аминокислотная последова- тельность амииокислотная последова- тельность С Сг С Св Св Св Сг Св С С ЦЗУ ВАКУ РИСАХ УРУНГ КЕТАААКГ БТИБ1ТВСИЕТС%КУ ЕКЦНИВЕЗТЯААЗЕЗНУ КТТЦАНКН11УАСЕСНРУ СНЦММКЕИНЕТКВМСКРУЯТГ УНЕБЕАВУЦАУСЕЦКНУАСКНСЦТНСУ тов, никакой нумерации, связанной с их расположением в полипецтидной цепи белка, ввести невозможно.
Их нумеруют для удобства промежуточных рассуждений обычно по взаимному расположению в системе, используемой для разделения. В приведенном примере они пронумерованы в порядке увеличения длины, а при одинаковой длине — произвольно. Очевидно, что Н-концевые группы всех Т-пептидов отличаются от Н-концевых групп С-пептидов, поскольку использованные для расщепления ферменты действуют по разным точкам.
Исключение составляют пептиды, полученные из Н- конца исходной цепи, они должны иметь одинаковое начало. Из рассмотрения приведенных в табл. 7.4 структур видно, что таковыми являются пептиды Т-10 и С-5. При этом пептид Т-10 входит в состав С-5, который в дополнение к Т-10 содержит остаток Г (фенилаланин).
Следовательно, пептид серии Т, примыкающий с С-конца к Т-10, должен начинаться с фенилаланина. Таковым в приведенной серии является только пептид Т-4, т.е. последовательность трипсинавых фрагментов с Н-конца молекулы Т-10, Т-4. Этот <двойной> Т-пептид содержит весь пептид С-5 и сверх того фрагмент ЕК. Следовательно, к С-5 должен примыкать пептид С-7, начинающийся с этих двух аминокислотных остатков.
Следующая за аргинином основная часть пептида С-7 является Н-концевой частью пептида Т-14, который примыкает в исходной структуре к Т-4. Восстановленная таким путем Н-концевая последовательность рибонуклеазы приобретает вид Т-10, Т-4, Т-14. Последний содержит остаток тирозина (У), т.е. точку расщепления химотрипсином. Поэтому третий слева пептид группы С должен начинаться с последовательности СНЦММК. Это позволяет записать блок С-пептидов на Н вЂ” конце в виде 0-5, С-7, С-9, Пептид С вЂ” 9 содержит в своем составе сразу несколько Т-пептидов— этл т, т, тв Тл т, т. тт т, т, т тц Тгг т т СК ЕИ ВИ ГЕВ. НьТК НУАСК ЕТСЯЯК ТТЦАНК УРНСАУК КЕТАААК НВЦТЯСУЦБУЯТИЯ1ТВСМ РУНТГУВЕЗьАВУЦАУСЯЦК Н11УАСЕВНРУУРУНГВАЯУ ЦНМВ%ТЯААЗЗЗНУСНЦИМК 1-2, Т-5, Т-З, Т-1, поскольку имеет в своем составе три остатка лизина и один остаток аргинина.
За последним лизином в составе С-9 содержится фрагмент руНТГ, с которого начинается пептид Т-12, который тем самым следует разместить эа пептидом Т-1. Дальнейшая последовательность восстанавливается на основании аналогичных рассуждений, при этом принимаем во внимание, что Т-12 содержит начало С-10; С-10 содержит целиком Т-6 и начало Т-11; Т-11 содержит 01 и начало Счг; С-б содержит целиком Т-7 и начало Т-9; Т-9 содержит С-3 и начала С-8; С-8 содержит целиком Т-8 и начало Т-13; Т-13 содержит С-4 и С-2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
