Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 75
Текст из файла (страница 75)
1( смоле попеременно добавляют очерслион синтов и рсагент для удаления концевой защитной группы. остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. Н течение всего процесса полппептнд остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан спнтезируемый полнпептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку: синтон (моиомер) — растворптель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизированного полипептидного синтеза.
Так, уже упоминавшийся синтез протеазы НИЧ-1 провели на автоматическом и пти шом синтезаторе Орр1)ед В)оэувтеи> и потребовалось около двухи. гй) 112 ( з'11. 25) (УП.23) оиуг 0 Р(ОХ)Х(з-Сз«г)з (У11.24) Х = СНз или С«зойзотХ превращения фасфатных остатков в электрофильные производные с одновреме ным обеспечением их избыточной свободной энергией эа счет сопряженного экзэргонического процесса. Так же как и при пептидном синтезе, для получения упорядоченных олигомеров необходима использовать защитные группы, чтобы на каждом акте конденсации соединять между собой строго определенные фосфорильную и 0«-группу, не давая развиться неупорядоченному процессу статистической поликонденсации.
Наличие у трех пуклеотидов экзоцпклических аминогрупп потребовало введения защит по этим группам, достаточно устойчивых, чтобы сохранять их на протяжении всего сиитеза, и в то же время удаляемых по завершении синтеза без повреждения образовавшихся межнуклеотидных связей. Первый синтез функционального гена был осуществлен Гобиндом Корана с сотр.
Синтез состоял из трех основных стадий: получения защищенных мономеров, конденсации их в олпгонуклеотпды достаточной длины и объединения их в двуцепочечную ДНК с использованием ДНК-лигазы, описанной в ! 5.4. Поскольку метод включает ферментатнвную стадию, его называют ги иихо-фермеититионмм синтезом Первый подход к образовашлю ллежпуклеотпдных связей основывался непосредственно на образовании фосфодиэфнрной связи и получил название фосфодизфириозо иетода синтеза, Фосфатпый остаток одного кол(понента (Р- компонент) активировали путем превращения в электрофильное фосфорилнрующее производное и использовали его для этерпфпкацни 0«-группы второго компонента (ОН-компонент).
Наилучшие результаты были достигнуты при применении триизопропилбензосульфонил хлорнда, который, как было показано, в растворе пиридина дает высокореакционноспособное фосфорилпирндиниевое производное Р-компонента (111): 0 0 !! !! ПО-Р-О + ( л — Рг)зСа« 50 С! -л (По — Р-050 Са« (( — Рг)з) -л ! ! 0 0 0 +пнридин ! ! Г ~ч лл-(-5 е ~+(' — Р ),ыллл).((() ! О 111 Это производное легко реагирует с гндроксигруппой 0«-коллпопепта: 0 0 !! .
!! г По-Р-Х~~+ ~+ «ОП' ПО-Р-ОП'+ ПХ~Д+ Ъ 0 О где П, П вЂ” нуклеозидные или нуклеотпдные фрагл)епты. Для того чтобы защитить аминогруппу аденипа, цптозпна и гуанппа, соответствующие нуклеозиды или нуклеотиды предварительно превращали в Х-бепзопл, Х-анпзоил илн Х-бутирильное производное.
'.!ти защитные группировки до снх пор остаются наиболее популярными в современных методах конденсации. Тем не менее прямое образование фосфодиэфнрных связей оказалось малоэффективным из-за ряда 294 побочных реакций, приводящих к ощутимому снижению скорости реакции и выходам, далеким от количественных. Фосфоэфирная конденсация была существенно улучшена путем введения синтонов, которые в совокупности с достаточно стабильными защитными группировками фосфатной группы (главным образом 4-хлорфенил) приводили к образованию межнуклеотидных фасфатных фрагментов, защищенных арильным остатком.
Этот метод до сих пор используется и называется фосфотриэфирнл(м меплодом олилоиуилеотидиозо синтеза. Хорошие скорости конденсации были достигнуты при использовании в качестве конденсирующего реагента (ррг)з Се«зЯОзо1 в присутствии нуклеофильного натвлизатора, например Х-метилимидазолида.
Основные стадии фосфотриэфирной конденсации могут быть представлены в следующем виде: О СИ О , СН ПО-Р— О + АгЯОзо1 + !)Г 1 -л ПО-Р— Х ! + АгБОз« + НС1 С«з !! (112) + ИОП'-+ПО-Р— ОП'+ НХ ! ! Однако в настоящее время синтез олигонуклеотидов в основном перешел на методы, основанные на фосфитной химии. Наиболее популярным из них является использование в качестве синтонов фосфитамидов (фасфорамидитов) (фосфитаииднмй метод синтеза). Синтоны, используемые в этом методе, имеют строение где ВНТг — 5'-бис-(и-диметоксифенил)фенилметил (диметокситритил), Нлг— Х (6)-беизонладенин, Х(4)-бензоилцитозин или Х(2)-з-бутирнлгуанин; Об бразование связи между Р- и О«-компонентами в фосфнтамндном методе происходит за несколько минут по сравнению с несколькими часами при фосфотриэфирной или несколькимн днями при фосфодиэфириой конденсации. ФосфиттРиэфиРный фРагмент да.лее окислнстсЯ РаствоРом 1з.
Таким обРазом, основные стадии конденсации можно представить в следующем виде: бпг!Мцс,о — СО(СНг)зСООН е МН (СНз)зб! — ф Агйс,С1, М- МЕтИЛИМидазОЛ б (М ',Π— СО(СН,),СΠ— МН(СН,),81 — ф Спейсср «йа~~!~ПЯ ) СРзСООН В СнгСЬг Омцс,',— - — Мцс',—" .„7' — Я ~ ! ) ! | ~ ~~ ~ ~ ! ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ и ~ ~ ~~ ~ З бгпйкцс,.ОР(ОСНз)М(гло-СзН>)г н ' (тегразол) в ацстоиитрнле бпз(Мыс!0 — Р— ОМис;.,- --Масг-43аЯчч — ф 1 осн | (снзсО)гО (кзпирование) 4-димстиламниопиридии, ацстоиитр бгп(мцо!Π— Р— Омцс),-" — Мыс',— ",: .
м — ф 1 осн, )г/ В ВОДНОМ ИнрндИНЕ О н бпг(мцс,о — Р— Омис',к-" — Мцс,—,ЙЛеЛ-Я ОСНз Пн „Сн,),м в диоксаис мн (коиц ) О 11 г бпз1мцс Π— Р— Омис О-" — Мцс О КО-Р(ОХ)-н(г СзН1)г+ ПОК'- КΠ— Р(ОХ)-ОК + ПН(! СгН1)г о |! КΠ— Р(ОХ)-КО' + 11 + И10 -в КΠ— Р— ОК' + 201 ! ОХ (Р11.26) Метильные и цианзтильные, а также ацильные остатки, защищающие зкзоцикличные ПНз-группы гетероциклов, удаляются по завершении сборки полной полииуклеотидной цепи. Другой метод, основанный на фосфитной химии, обычно называют )!=фпср(окатным .цспюдв.е сихгпезл. В этом методе используются Н-фосфонатные снн- тоны !сг 01вТг 0 — Р— 0 ! П 113 Н-фосфонаты активируют обработкой пивалоилхлоридом(СН1)1СС(0)СЕ Межнуклеозидные Н-фосфонатные связи достаточно стабильны и могут окисяяться до фосфата по завершении образования полинуклеотидной цепи.
Конденсация приводит к Н-фосфонат фосфодпзфиру согласно реакции 0 0 |! |! КО РО + (СНг)зСС(0)С1+К ОП г КО 1 ОК + С1 (г'П.27) ! ! Н П Перед каждой стадией конденсации как в фосфитамидном, так и в И.фосфонатном методе остаток ОМТг удаляется с растущей полинуклеотидной цепи слабой кислотной обработкой, освобождая 5'-ОИ-группу для следующей стадии роста синтезируемой цепи. Оба метода легко автоматизируютсл в твердофазпом варианте аналогично методу, предложенному для пептидного синтеза Меррифилдом.
Более того, фосфитная химия вообще чрезвычайно редко применяегсл в лспдкофазном варианте. В качестве носителя используют тлавным образом силикагель или пористое стекло. Их обрабатывают так, чтобы ввести аминогруппы, которые в дальнейшем В;„.':;,'1,:.:,'Н, -, ".::х,; уз!О,'.;.'.':..„',,'.",,ув 1'Мйсч' О' — Р— Овцс: "'О-:, =Мыс ", ! и .. 1 л!:.
'.:,.1 Ркс. 82. Схема твердофазногп синтеза дезоктк)зкбоолкгокуклготидпв фосфктвмидкыы мето- дом. НЦ, — КУКПВОЗКДЭЛ Мил, — КУКЛВОЗКДЫ, ЗВЩКЩЕККЫЕ ПО Мну-ГРУППЯЫ ГстЕРОЦККЛОВ; 8ПЗ! — Диквтп- кскгрктилькая группв. Посля кккдпго цкклв г возрвсгввт кв едкккцу, пока ке досгннгвт желаемого значения 1 л. Стадия кэпкраввккя праввдктся двя првврацвквя следов квпрорввгкровввщвл усОН-!рупп в вцвгвкскгруппы.
Ппсле очистки целевого продукта лрпмвтогрвфкеа дкквтокскгркткльквя группа улаяавгся 49, вон НО Н йА 4 дик- !+атф ила ! 1-й ОН 0д>Т !!Аг н !л;М Ф днй >лггалл (+атФ иглг идо ! г'„1-й (А)!! но !л И ~ л'0 Р ОН 7.!!. ГГПГТГИЧВСКЛЯ ИНЖВ!!Е!'ИЯ 299 '. !Ч -19-Ч, Рис. 83. Схема ступенчатой сборки фрагмента двуспиральной ДИК из олигонуклеотйдов 1, !1, Ш, !Ч, Ч с помощь>о ДНК-лигаэы, Всртикальиь>ми линиями показаны ггомплементдрнь>е взаимодействия взаимодействуют с 3'-концевым нуклеозидом через определенный спейсер, например фрагмент янтарной кислоты.
На рис. 82 представлена схема фосфорамнпитного синтеза олигонуклсотида. Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидного синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигаиуклеотпдов, полученных фосфодиэфирным методом (рнс. 83). Для соединения олигонуклеотидов 1 и 11 используется третий, вспомогательный, йуклеотпд П1, который комплементарен 5'-концу одного и 3'-копцу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид П1 играет роль матрицы для олигонуклеотидов 1 и П, причелг его 3'-конец кол>племептарен 3'-концу олигонуклеотида П, а 5 '-конец — 5 '-концу олигонуклеотида 1, несущего фосфомоноэфирную группу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
