Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 78
Текст из файла (страница 78)
Методы генетической инженерии стали важным инструментом биохимических исследований. В частности, онп не только открыли возмозкность получения значительных количеств ранее мало доступных белков, в том числе эукариотических, но и возможность внесения направленных точечных изменений в первичную структуру белков, т.е. замены одного определенного амипокислотпого остатка на любой другой произвольно выбранный амипокислотпый остаток (в пределах 20 аминокислот, из которых могут строиться полипептидные цепи при трансляции). Это достигаетсл путем замены соответствующего кодона в гене, программирующем исследуемый белок Такая процедура называется сойпюспечи!(зичпыж,иутазенеэояь Одна из наиболее употребляемых схем такого мутагепеза приведена на рис. 83.
С этой целью исходный геи встраивают в двунптевую реплпкативпую форму ДНК фага М13, зрелые частицы которого содернеат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. 5 5.7). Введение полученной рекомбипаитпой дНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантпую дНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полнмеразы, Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты.
При этом по обе стороны от этого тринуклеотпдп праймер полностью комплементарен рекомбинантпой дПК, а в пределах этого трнпуклеотнда заменен таким образом, чтобы в образузощейся при репликации минус-цепи образоп;шпсь запла- нированная мутация. После превращения комплекса ДНК-прайм -пра мер в замкнутую двунитевую структуру последнюю снова вводят в бактериальные клетки, в которых начинается производство плюс-цепей, несущих мутацшо б в вы раином участке (сайте), а затем и формирование мутантных частиц зрелого бактериофага. Такие направленные изменения в белках (6сяхоаа ) я о ая инженерил) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций.
В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. 2 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктуриого анализа высказывалась точка зре р ния, что гидроксигруппа этого остатка принимает част у ие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пелтидной связи и о иов еме д р нно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, ког а м д етодом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фепилаланин, оказало сь, что каталитические свойства фермента практгически не изменились. Таким об разом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась.
Встраивание генов неизвестного строения в ДНК фа М!3 " фага , приводит к получению ДНК, у кото ой на я с . ' р ' р ду хорошо известной последовательностью имеется фрагмент неустановленной структуры. Такая конструкция очень удобна для установления первичной структуры встроенного фрагмента лгетодом Свитера (см. . ), тот одход становится одним из осгювных для по то ф 278).Э л подготовки рагментов ДНК самого разнообразного происхождения к заключ акл чительной фазе секвенирования.
7.12. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СЕЛЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Геггетическая инжег женерия открыла новые возлгоягности перед учеными и биотехнологами в значительной мере в результате применения селекционных метод, отбора клонов микроорганизмов с определенными свойствами. Появление дов т.е. от о а метода амплифика ии н кле ф ц у. иновых кислот в последнее время привело к рождению подходов, основанных на селекции нуклеиновых кислот гл ег!го, т,е. на молекулярном уровне (дголекуляриая селскчия иукяеиггооыя кислот). Действительно, если имеется способ с е р ди множества нуклеиновых кислот отобрать такие, которые обладают оп е елен р д ными свойствами, то далее возможно размножить такие нуклеиновые кислоты с помощью амплификации (см. '2 7.5) и далее, если т б его ре уегся, повторить селекциго еще один или несколько раз, Таким образом, все, что треб ется ля о б тр у д тбора нуклеиновых кислот с заданными свойствами, — это иметь исходный мате д " терпел для селекции и способ его отделения от остальной массы материала.
Что касается мате нала риала для селекции, то получение огромного многообразия нуклеиновых кислот в вн; е д смеси не представляет труда. Для этого достаточно провести синтез, использ я на у некотором числе этапов слгесь всех четырех лгономеров вместо ин иви ь д дуал ных мономеров. Это легко сделать па автоматах для олигонуклеотидного синтеза.
Э Этот процесс часто называгот рандомизованным синтезом (от англ, гапН Нов — беспорядочный). Нетрудно оценить, что в 1 мкмоль смеси, содержащей 40-мерные рандомизовапные последовательности, будет 44а = 306 = 10™ различных последовательностей, т.е. скорее всего вообще не буде х т дву ' одинаковых молекул, поскольку 1 мкмоль содер- э 2 1 жит всего порядка 10'а молекул. В простейшем сдучае, чтобы в дальнейшем беэ всяких специальных ухищрений проводить амплификацию, желательно, чтобы рандомизованные последовательности находились между двумя участками с определенной последовательностью, которые после Г 4 селекции могли бы быть использованы для праймеров.
Проще всего представить себе селекцию ДИК па способность связываться с определеппымн лигал- Рис. 86. Схема селекции для дами. ДлЯ этого достаточно иммобилизовать ли- лол чения РНК со сродством ганд на нерастворимом носителе, например на к неболыцим лигандам: агарозе, и пропускать полученную смесь большого г - участок дяя ампяифнкации числа разнообразных нуклеиновых кислот через дик соответствующей продукту колонку.
Задержанный на колонке материал после синтеза; 2 - ракдамяэаямгггыяс элюции может быть амплифицирован и подвергнут фгктмснт' э Учкстак длк кмндн фякации ДЛК; 4 - аффниная наследующему циклу селекции. Метод легко переносится на селекцшо молекул гюгдсм; а - кфинкая храматотрк- РНК (рис. 86). В этолг случае на одной пз сторон фия н эяюцня; с - оерктякя подвергаемой селекцигг молекулы должен помимо тракскрниггия; а - амяяифнккцня; г- транскрипция праймера находиться промотор для 1'П14-полимеразы, например фермента фага Т7. Получаемые ДПК илн РНК с заданными свойствами называют ашяяягсра.еи. Повышешгый интерес к РПК-аптамерам в значительной степени связан с попытками создать рибозпмы с новыми несвойственными природным рггбозггмалг каталггтггческгглггг характеристиками.
Уже описаны РНК-аптамеры для некоторых алшнокислот, для аде~овина и адениловых нуклеотидов, включая АТФ, для коферлгеггтов и кофакторов, участвугощих в окислительно-восстановительных реакциях — никоти~ам~дных и флавиновых. Одно из более сложных цримепешиг молекулярной селекции нуклеиновых кислот связано с попытками создать иа этой основе рцбознмьг с новыми каталитическими функциями. С этой целью цообходимо создксо новые методы селекции. Как уже говорилось в ! 6.4, открытие рибозлмов вызвало поцьгшен~ый интерес к возможности участии рибозцмов на первых этапах эволюции. Для этой цели необходимы рибознмы с синтетичсскнлш фу~кциялш. Пляш приводится пример получения с помогцью молекулярной селекции нуклеиновых кислот фермента, катвлизирующего реакцию соединения двух оянгорибонуклсотидов, один из которых (донорный) несет на 5'-конце трифосфатную группу, с помощью которой с отгцеплеппем пирофосфкта осуществляется образовшгие новой меягнуклеотидной связи с 3 -ОН-группой акцепторного олигоцуклеотида.
Эта реакция по своему типу идентична реакции злонгации полгшуклеотидной цепи, в ходе которой осуществляется перенос нуклеотидного остатка от нуклеозпд-5'-трифосфата на 3'-ОН вЂ” группу растущей полинуклеотидиой цени. Схема селгкцшг представлена на рис. 87. Для большей эффективности этого процсссгг трифосфатная группа и 3'-ОН-группа донора должны быть сблггягсггы. Это могкцо сделать создав коцструкцию (рис 87, а), в которой этп две группы оказываются г омплсментарпыми соседним нуклеотидам стебля ц шнилечной структуре. Па 5 '-конце акцепторного олпгопуклеотида имеется последовательпостлм с ползощью которой он может сорбироваться на аффиппой колонке, содержащей комплементарпый этой последовательности олпгонуклеотпд, иммобилизоваииый иа ага- розе.
Прп смешении обоих олигоиуклеотидов небольшая часть допориого материала, обладающая каталитической 5 ! л активностью, соединяется с а акцепторпым олигонуклеотидом (рпс. 87, б). Образовавширкя продукт мозкет быть сорбпрован на аффиппой ко.чопке. П)п~ этолц естествошло, сорбируется и пепроРис.
87. (Млгкции рибазима г РНК чигязнаи як- реллгировавшпй акцеиториый тивиаггью: олигопуклеотид (рис. 87,а). После десорбцпп проводится обратная транскрипция отобранной !'ПК и полученная ДП К, соответствующая продукту синтеза, амплифицируется (рис.
87, з). Так как используемые для амплификацпи праймеры относятся один к донорноллу, а другой к акцепте!знал~у фряглипту, то Д)1К-копия непрореагировавшего акцепториого олшопуклеопы(а ямплификащш пе подвергается. Таким способом проводится вторая селекция, Для иродолзкепиз~ процесса нужно провести траискрипцшо той части амилифпкатя, который соответствует донорпой РПК, Для этого проводится повторная ашпик)яи яция с праймерами, соответствующими концам фрагмента, подле,кшцего транскрипции, причем праймер, распололкениый в области стартовой то ио~ транскрипции, спабмсеп промоторной последовательностью для Т7 РП!(-полимеразы )рпс.
87, з!). После этой повторной амплпфикацни проводится т!запек!зишцпз~ и восстанавзпиплгчгся доиорный фрагмент, но у,ке прошедший цикл селекщщ, тх. теоретически солюржащий только каталитически актщлпый чачерлплч, и прякти каки существенно обогащенный по каталитически актпвпьш последователышстям.
Ото дает возможность провести еше один или несколько цш лов селекллии В описывасмой работе удалось получить рпбозим, который катализировал реккщио лигпроваиия с константой скорости 8 ч ', прн том что самопроизвольпал реакция лпгнровапия в этих условиях характеризуется константой скорости 3 П) " ч'. Приведенные примерля наглядно дел опстрирулот, что метод молекулярной д! 7 — 5 -каяцзяая фрягмеят даяаряая РНК: З вЂ” ряядамязавяяяыя фрягл«яг РНВП У вЂ” якцаччаряыи ачягаячкчаатид: б — кффяяякя качаякя с яммабячязааяяяым а ч1гаяукчаатядам камячемеятяряым 5 -лачим ющаягаряага ачлааяякчеатядю б — прчимар дчя ямпчяфякяцяя ДНК, саагяятюыющяя ярадукза сяягезя; 6 — яряямар Зчя ямяяяфиющия участка ДНК,кадярчющега дакаряыя рябаачягаяукчаатяд, сякбжеяяыя чраматарам дчя Т7 РНЛ- яачимерязы 308 селекции нуклеиновых кислот уж о уже в своем сегодняшнем состоянии позволяет осуществлять цел енаправлеипьпл поиск среди неисчерпаемого многообразия нуклеиновых кислот структур, спасо ~ обных к связыванию определенных лигапдов и рибознмов с и ов с новыми типами каталитпческой активности.
Скорее всего зто лишь первые шаги нов ового направления в биохимической техполоюш. 7.13. РЕПТГ18ПОСТРУКТУ)зПЫй зП!АЛИЗ БИОПОЛИМ)лРОВ (7.7) ,У а = 2т)ц 5 л' = 2Я"' э" с ю 2т), где .з — !э — э) — разность волновых векторов падающего и» кристалл и рас- где .з = ,эа — э сеянного лучей; а, а, с — векторы элементарной ячейки кристалла (рис, 88); И, )с, 1 — целые числа.
По определению, модуль волнового вектора равен 2т/А и, сле- довательно, модуль вектора э' может принимать люб, бые значения, ие превыша- ющие 4т/Л, Рассеянное излучение мозкет быть зарепютри!ювю " ло либо с помосцью рентгеновской пленки, либо с помощью спецпач1япях с ыт~ с е иков зелютеповского изл чения. На пленке получается типичная картина (р . ' ), нс. 89), состоящая из у 30з Единственным методом, который позволяет определить пространственные координаты большинства атомов биополимора (как правило, всех, кроме атомов . О и имепим к тем биополиме- водорода), является рентгеноструктурный анализ.
Он пр остаточно большого раз- ам, которые могут быть получены в виде кристаллов д с мера, по крайней мере несколько десятых долей миллиметра. Для биоиолимеров, имеющих вытянутую нериодпческую пространственную структуру, например для двуиитевых спиральных структур нуклеиновых кислот, геометрические параметт быть пол челы исследова- ы, описывающие основные элементы структуры, могут у ры, пнем дифракции рентгеновских лучей иа ориентированных я .: нитях этих биополи- ме ов. Именно такие данные, полученные для нитей Д пПК английскими учеными Уилкннсоном н Розалинд Фрапклни, позволилн Уотсону и Крику предлозкить пространственную структуру ДНК в виде двойной спирали. Возмозкиость получе- ния елка, н ' белка нуклеииовой кислоты или их комплекса в виде кристалла достаточно высокого качества является основным ограничением ~ у" ш и тп исследования прос- транственной структуры биополимеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
