Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 80
Текст из файла (страница 80)
Это излучение характеризуется сплошным спектром, пз которого с помощью соответствующих монохроматоров молкно вырезать излучение желаемой длины волны. Интенсивности синхротронного излучения, достигаемые в лющных Р Л»»ст >л к»рты ис 9! ускорителях, существенно превышают величины, дос- э»»лтрс»»»нс»»» плотности цнтижимые в рентгеновских трубках, что позволяет су- та»дал» ~ » см нз Рм»»!а»аащественно ускорить сбор информацн»» в рентгеновских садсржщден гем дифрактометрах. Кроме того, возможность»шмонать длину волны и, в частности, проводить»юмаргния так называемого аномального рассеяния вблизи края полосы поглоп»ения ре»птгновского излучения рассеивающих атомов позволяет по-новому бояее эффектшшо решать проблему фазовых множителей и обходиться без нзоморфного замщцения.
7.14. ДВУМГРНАЯ ЯМР-СПГК!'!'ОСКОПИЯ БИОПОЛИМЕРОВ Методом рентгеноструктурного анализа монокристяллов установлена детальная пространственная структура сотен белков, зна штелыюго числа олнгонуклеатидов, нескольких транспортных рибоцуклеиновых кислот. Однако встает вопРос, в какой мере установленная структура соответствует той., которая имеет место в функционально активном состояппи бнонолииера в растворе ил»л в составе живого организма. Априорно нельзя н»» исключ»»ть, ни о»»енить масштаб искажения структуры в результате форм»»ров»пня криста».шческой решетки.
Поэтому весьма существенно !загполяг»сть независимой» информацией о геометрии люлекулы биополимера, пусть но столь полной, но зато аоот»»огсз»»у»о»»»е»» ее состояишо в Растворе. Из эксперимент»льных методов наиболее цроч~ьк позиции завоевывают нодходы, основанные на»»спользовании ядер»аса эдас»ит»аса Резака»си, в первую очередь ядерного эффекта Оверхаузера. Известно, что все ядра, имеющие спицовоо квантовое число»/з, в постоянном маги гиитном ноле со значением магнитной индукции В могут находиться в двух незав авнсимых состояниях, соответствующих ориентации ядерных магнитных маме ментов по направлению и против ня~Равлгння ноля. Из ядер, входящих в саста ав биополимеров, такими явля»ется ядра»!1, '»0 и з'!'.
Разность энергий, соотвегствующих двум состояниям, составляет дсу,д, где д — фактор Ла»»де — без- 'Я ' размерная величина поряд ка от нескольких десятых долей единицы до нескольких единиц, имеющая характерное значение для каждого типа ядер (наприллер, для протона у = = 5,584),  — константа, й называемая ядерным маги его и ам и равная 5,051 1О этА и-'. Поэтому -т -8 -7 ири облучении ядер, Рис. 92. сййигмеит сиглтлж 'Н ЯМР л иаходлщихсл в магнитном иииирситииигкои рибоиукколиы: иоле, радиочастотным излучением с частотой и = ~ от лтомоь ири ат и ('л имит,м ~икот лотыси Ни-ло5: Нт и Нт ' - то же. дои Н!л-лло; Нт „Нэ ' = уВ В/Ь происходит резомж лои НМ-лж НВ и Н4 — то жс, вои Н!л-4а и*и с иое поглощение энергии излучения, которое фиксируется как сигнал ядерного магшлтиого резонанса (ЯМР).
В наиболее эффективных современных Г!\!Р-кис кт!лол~етр»х используются поля 10-15 Тл, что в случае протонов соответствует рскюииисиым частотам 400 — 600 МГц. Так как <ами ядра и элсктроиы, составляющие молекулы исследуемого вещества, могут быть источниками локальных лилгиптиых полей, то величина магнитной индукции в точке нахождения некоторого ядра, входящего в состав этих молекул, отличаегся от вели шиы, создаваемой мюиитом ЯМР-спектрометра, на малую, но доступиуто измерению величину ЛВ .
Г!оэтоллу радио- лок излучение с частотой 7 поглощается не ири индукции внешнего паля, равной Ьи(уВ ), а при В = Иа(В — ЛВ „). Однотипные ядра, иаирил~ер протоны, в разных частях молекулы ил~еют разное магнитное окружение и резонируют при !таили илюилихси значениях В. Это дает возможность при высокой разрешающей силе ЯМ Р-сиектромстра получить отдельные сигналы для каждой группы однотипно расиоло.ивиных в молекуле ядер. В качестве примера иа рис.
92 пршлсдеи фрагмент протонного !'П) спектра ЯМР фермента рибонуклеазы в области, где резонируют щютоиы, связанные с атомами С2 и С4 имидазольиых колец остатка гистидиии. Всг четыре остатка гистидина, находящиеся в молекула фермента в пололкоииях !2, 48, !05 и !!У дают отдельные сигналы, отличаюгциеся иа несколько миллионных долей (льд-) от магнитной индукции, создаваемой магнитом ЯМ!'-сиектромотра. Условием стационарной регистрации сигнала ЯМР является иашчие доста точно быстрой релаксации избыточной эио!тгип, полу щепой систелюй ядер, р~ зонирующих при определениолл значении индукции висишсго магнитного волги Релаксация молкет происходить как путем передачи энергии иа другис сиишовис системы (спин-спииовая релаксация), так и иа другие степени свободы (спин решеточная релаксация).
В противном случае за короткое в!лоло~ заселошлость обоих энергетических уровней иыравияигся, дальнейшее поглощение эиергш' прекратится и сигнал яХ!Р регистрироваться не будет. Произойдет насыпи иис юл системы спиноз радиочастотной энергией. В промежуточной области по мере приближения системы к насыщению будет наблюдаться уменьшение интенсивности сигнала. Частичное или полное насыщение системы спинов л может происходить не только при наложении внешнего радиочастотного поля на резонансной частоте спинов л, но и при насыщающем облучении другой системы спиноз т', пространственно сближенных с л' в молекулах исследуемого соединения до расстояния не более 5 а.
Эти эффекты связаны с процессами переноса избыточной энергии от сникав ~' к спинам л по механизму диполь-дипольной кросс-релаксации. При этом чем меньше расстояние между ядрами л и т, тем выше скорость кросс-релаксации между ними, и, следовательно, тем эффективнее перенос энергии от спинов т к спинам л.
Таким образом, если пара спиноз л и т связана дипольдипольным взаимодействием, то в условиях селективиого насыщающего облучения на резонансной частоте ядер т происходит изменение равновесной заселенности энергетических уровней ие только спинов л, ио и спииов л, а значит, в ЯМР-спектре помимо полного подавления сигнала ядер л' будет наблюдаться частичное изменение интенсивности сигнала ядер л. '1'акое изменение спектральной интенсивности сигнала ядер л в условиях насыщающего селективиого облучения иа резонансной частоте 'ядер т' называют Ядсрплллк эффсктож Оосргауэера (ЯЭО). Величина ЯЭО0, наблюдаемая между спинами т и ф в ЯМР-эксперименте, определяется значением скорости кросс-релаксации ао между ними и длительностью времени облучения 1: (7.13) МОЕ,(7) = та!. В свою очередь, величина кросс-релаксации а, для пары спинав л и / представляется как функция времени корреляции т и расстояния г, между ядрами л с и 72 -улйт(т — 6т.
I! + 4ыогэ) с с с ач 2т!0гв (7.14) где 7 — магнитогирическое отношение для данного типа ядер; Ь вЂ” постоянная Планка; т — время корреляции межспииового вектора л — л л, оло — частота с спектромвтра (тай/вес), Если скорость вращения молекулы во внешнем магнитном пале вел~лка (т.е. время корреляции молекулы т короче, чем иг1, где ото — резонансная частота) с а л то ач положительна, что означает увеличение интенсивности сигнала т в услоВиях насыщающего облучения сигнала т' (яЭО, > О).
Эта ситуация характерна дчя маленьких молекул. В случае больших молекул, характеризующихся медлен- ным вращением с временем корреляции т > ол л, а, отрицательна, т.е, уменьшает- а ся интенсивность сигнала л в условиях насыщающега облучения сигнала У'(ЯЭО0 < 0) В то же время видно, что а, (а значит, и ЯЭОо) является резко убывающей функцией расстояния между протонами л и т' (аи» г*л).
Поэтому величина 5!ЭО. -в измеряемая в ЯМР-эксперименте ири определенном времени облучения 1, мож дать информацию о скорости кросс-релаксации (см. уравнение (7.13)], а значит и о расстоянии между определенными ядрами в молекуле (см. уравнение (7.1б)] Таким образом, определяя экспериментально ЯЭО для различных vар ддер исследуемой ыолекулы, можно получить количествеппу|о информацию геометрии молекулы.
Спектры ЯМР биополпмеров, содержащих большое число одинаковых ядер представлены большим числом перекрывающихся сигналов, и отнести каждый сигнал к олределенпому атому и оценить сто интенсивность для измерения эффекта Оверхаузера является сложной, далеко не асегда выполнимой задачей Возможности ЯМР-спектроскопии в копформациопном анализе бионолимероа существенно расшпрнлпсь вследствие разработки новых методик, в частности двумерной (2П) д-ко!зреляциониоГ! спектроскопии (СОПУ вЂ” СОгге1асе<5 ПрессговсорУ) и ряда ее модифнк|щий и 2П-спектроскопии лдериого эффекта Оиерхаузера ((УОЕПУ вЂ” Нис1еаг Очег!илияег ЕГ Гесс Н!зессгаясарУ).
Любой 2П-ЯМР-спектр может быть представлен в виде диаграммы, построенной в системе координат резонансных частот вдоль вертикальной и горизонтальной осей. 2П-ЯМР-спектр состоит из диагональных сигналов, представляющих собой обычньш 1П-ЯМР-спектр, и кросс-инков, которые располагаются вне диагонали. Именно |Нюсе-пики несут ирпициии|<льио новую (по сравнению с 1ПЯМР-спектром) ииформяцшо: наличие кросс-пика л|елкду л|обыл|и двумя ядрами свидетельствует о ЯЭО (в ел!чае МОЕЯ-спектра) изи| о сипи-спиповом взаимодействии (в случае СОЯ-спектра) мезлду этими ядрали|.
В 2П-СОПУ- и МОЕЯ-спектрах сигналы мак!зомолекул идентифицируют, используя методологшо последовательного отнесения сиги ьяов, разработанную для определенных типов ма|.ромолекул (белков, нуклеиновых кислот, олиго- или полисахаридов). С' использованием кросс-пиков СОПУ-сне<стра ядра, связанные скалярным спин-сиииоиьв| взаимодейстиием, обьедиияют в соответствующие спиновые системы. Хотя СОВУ-спектры иомогяют установить связь между ядрами одной спинозой системы и часто содержат оесьма полезную информацию о величинах констант спин-с|шноиого взаимодействия для любых пар 3-взаил<одействующих ядер, в иих отсутствует ипфорлщция об отиос|ггельиом расположении данной гпиноиой < истемы в последовательности бпополимеря.
Эта информация может быть получена из ХОЕЯ-спектров путем и|ализа кросс-релаксациоииыл взаимодейстш|й, которые осу|иестиля|отся черсз пространство для ядер соседних остатков биополимгри. Эта информация, пспользуел|ая в кол|б|шации с даииыл<и СОПУ-эксперл<л)ентов, с учетом известной последовательности бионолнмера обеспечивает практически полное (|пи vо гп| полное) отнесение сигналов макролюлекул ы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
