Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Однако и:ь шести остатков тнронща, входяноьх в состав фермсн" находящихся в положениях 25, 73, 78, 92, 97 н ! 18 ьюлицеьгпьдной цепьь, суще уцественно модифнцнрованньцш оказываются лньщ, Туг-73, Туг-76 и Т г-115. у 5. Следовательно, именно они находятся на поверх> о рхности молекулы рпбо нуклеазы, а остальные спрятаны внутри глобулы. В нуклеиновых кислотах остатки, участвующие в образо азов ап ии водород н ы х связей с комплементарными гетероцпклами, имеют, как правило, вцло, резко спи>кен- ную реакционную способность по сравпешпо со свободными ге е ., П гетероцпклам и. !! ап- ример, реакция (У11,2) остатков аденниа и цнтознна с галоге .
вло> епацез>щ> лег«дами проходит с участием экзоциклпческой амппогруппы и атол>а азот а ота гетероцикла, которые являются непосредственными участниками уотсон-криковских взаимо- действий (см. ис, 26). П > тся остатки, " ( . р .
б). Поэтому в этенопроизводпые легко превращаются ест находящиеся в однонитевых участнах, н существенно труднее — остатки, образу ющие двуспиральную структуру. Реагепты, различающие одно- и двунитевые структуры пол инуклеотидов, широко используются для детального ального изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот, в частности для выявления шпилеч- ныхст кт .Втаб. ру ур.
л. 7.7 цриведепы некоторые реагенты, широко применяемые для изучения пространственной структуры белков и пукпеиновых кислот методом химической модификации. Мето д нашел также широкое применение для выявления элементов простран- ственной организации комплексов бнополил>еров, в частности комплексов белков с нуклеиновыми кислотами.
Если, например, фрагмент нуклеиповой кислоты принимает участие во в,>апмодействип с белком, то реагепт, де а' >, действующий на свободную нуклеиновую кислоту, не сможет атаковать фрагмент, экранированный молекулой белка. Поэтому на карп>пе, отражающей распределение модифициро- ванных фрагментов вдоль цепи нукленповой кислоты, па участке, закрытом бел- «, удет наблюдаться резко понпмеепний уровень модификации, своего рода ком б отпечаток белковой молекулы. Этот метод получил название фуп>в7>иип>ии>а, что означает <отпечаток ноги>л Наряду с химической людифпкацпей для тех же целей мол«по использовать ферменты, катализирующие гпдролнз нуклеиновых кислот.
Например, в экспери- ментах по футориптппгу комплексов Д!! К с белками часто используют япнхре- а>пичесхую деэохснрибоиухмеаэу (ДПКаза 1), которая выделяется в пищеваритель- ный тракт млекопитающих подмселудочпой >нелевой. Этот фермент каталнзируег гидролиз внутренних фосфоднэфпрпых связей в двупптевых и однонитевых р р р менной обработке ДПК этил> ферлкнтом, проведенной так, чтобы в среднем на каждую молекулу ДПК пришелся одш> разрыв, расщепление приводит к об азова р ншо фрагментов самой разнообразной длины, легко регист- рируемых с помощью гель-электрофорсза.
Прп такой же обработке комплекса ДНК с белком ас е р щ пленпя в у >ветках, экранированных белковой молекулой, не происходит и фрагменты соответствующей длины иа злектрофореграмме пе обна- ру . рис. 94 в ка >естве примера приведен результат исследования с руживаются. На ис. 94 помощью футпринтннга фрагмента ДНК с ферл>ентом РНК-полпмеразой (см 2.3). Отчетливо ви, . ). деп участок длиной около 40 пуклеотидов, закрываемый РНК-полил>еразой от Д азы .>П Казы 1.
Оп вкл>очает !5 нуклеотндных остатков, которых происходит транскрипция (опп обозначены положительными номерами) и предшествующий участок, с которым !'!!К-полил>ераза взаимодействует, чтобы зафиксироваться в поломн нпи, пеобходплюм для начала процесса транскрипции Для изучения пространственной организации кол>плексов бнополиме о шиРО р в ко применяют методы, основанные па сшивании компонентов ком 324 Т б л и ц а 7 7 !!>.которьн. реа>знты н*иб>и>ос широко нрнмышсм>к >ощ изучения пространственной сгруктуры белков н нуююнновых кислот (Р - условное обозначение белковой молекулы) Моднфицнруемая группа Реагент Прил>еры некоторых реакций ((и.
Нсл ((н нсл ! р) — нн, + с>н,о-5 — сн> — Р— нн-6 — сн, + с,н,он Х-Концевая о-амино- Имидоэфиры группа е-амнногруппа лизина й-Концевая о-амино- Формальдегнд, апьдегид ОР-НН> л НСНО (Ру — НН вЂ” СН>ОН > Р! СН нн группа, е-амнно- группа лизина ОР нн> л ясно ОР н>>>сня ОР нн сн>я Х-Концевая, а-ами- Ангидриды днкарбоновых кислот о сн, !! ! ОР— НН вЂ” С вЂ” Си С вЂ” СОО ногруппа, е-аминогруп- па лизина ~лн Π— ' -о-с-си нн+ + -о-~-1 — си, Бутандион Гуаниднногруппа аргнннна Я(-Группа цисеенна, атом серы мееионина, атом азота нмидаэоль- Бром- нли нодуксусная кислота (ОР ВН + веСН> СОО ОР В СН>СОО >вал ного кольца гнстидина Имидаэольное коль цо гистидина Днэтилпиро- харбонат Р ) + ! С>Н>ОСО !> О ® (~~Д Н ! о Свл хос>ил ~Р-П~~ — ОН Р > ОН + Н! ! Иодирование Нитрование Остатки тирозина э-аон + с>но,>, + с>во,г;+ н' Остатки тнрозина (эамещение протона ароматического кольца тирознна) о Ое-нн, + ) сн, ,рн> й Продолжение табл.
7,7 Реагент Примеры некоторых реакций Модифицируемая группа Примеры некоторых реакций Реагент Модифицируемая группа ВЛ-Группа цистеина Аминоэтили- сн~ ~Р1-СНззН +~ НН (Р)-СЗЗ 2 сн сн нн м ю н Диметил- сульфат рование И-Этилмале- Я1-Группа цистеина, а также остатки гисти- (Р)-СНззи + 3 ~н-Сзнз Е" ~ зН имия дина и лизина ЯН-Группа цистеина ОР-5Н+ Озн~~~ Х -5-5-~~ НО, соо- ~>:оо- о Урацил, тимин, ци- тозин Гндразин + аннин,+ нн;со-мнз — ОР -5-5 Моз + Нз ~~~ ~-НО ~оо- ~соо- Аденин, гуанин Диэтилпиро- карбонат ,„. О ..о.н-О з $ н н нн,есн, нзГ ~~~'н ОА н нносн, Урацил, цитозин Гидросульфит натрия а-Дикарбо- Гуанин (Н1) и экзоннльные соеди- циклическая аминонения группа 050, Гид1юксилнрование двойных связей тими- Х = Н - глиоксаль Х = СНз - пировиноградный альдегид Х = СНзСНОСтНз - 3-этокснбуганол-2-алем-1 О О на, урацила.
цитозгпза (Т > О > С) нн, н Адении, цитозин О он- 11 Я вЂ” НН вЂ” С вЂ” Низ 327 Реагент Зллмана (ВТ1ЧВ) б,б-дитиобис- (2- иитробензоат) Ди ц иклогек- силкарбоди- имид Концевая карбоксильная группа и карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот По двойным связям цнтозина, урзщила и тимина (Т < О < С) О Нз Нн ОН он 1 0 Р о Метиловый эфир гидрокси- ламина Хлор- или бромацеталз дегид Гуанин (Н7, Н1), аленин (М1, > Н7) > Н3 цитозин (Н3) нн, С з.>""" Продоллсекие табл.
7.7 СООСзиз нн, н~ чан + СзкзОН + ОН '1 Продадгкенис табл. 7. Примеры некоторых реакций Мбдифицируемая группа Х-Алкил-Х-и- итроземочеви М ежнуклеотидный фосфат, гуанин, аденнн, цнтозин Х7(С) > > Х1(А) > ХЗ(С) о-н, 1~си„с,нэ Ю г(фф аив ® е б плекса с помощью бифуикииоггалвных реагситее. Эти реагенты содержат в своем составе две одинаковые п.ш различные группы, способные прпсоеднняться к каким-либо остаткам биополимеров. Наприлгер, при обработке рнбосом дпэтилсубернмпдатолг, реагентом, содержащим две импдоэфпрные группы, атакующие б-алгиногруппы остатков лизина, белки, находящиеся на достаточно близком расстоянии друг от друга, могут оказаться ковалентно связанными (сшитымп).
Определяя, какие именно пары белков рибосом оказались сшитыми в результате такой обработки, можно получить ценную информацию о пространственной организации рибосомы. Если бпфункцнональпый реагепт может взаимодействовать как с белками, так и с пуклеиновымц кислотами, то с его помощью момггго определить, какие нмеппо белки непосредственно связаны с нуклепповой кислотой в ггугыгеоп1готеггдах Так, обраба- тываЯ Рибосолп г Реагептолг гггРаггс-'1(гг(ХНг)гС1г), в котоРом ионы С1, коордшшровашпле попом (ггг', могут быть замещены па пуклеофиггыггжг группы белка (8СХв — группа метпогшпа, 8Х вЂ” группа цистеина, пмпдазольное кольцо гистпдггни и др.) н азотсодергкащпх гетероциклов (в первую очередь Х7 остатков гуапнпа), можно определить, какие пмеппо белки в составе рибосомы непосредственно контактируют с рпбосовшой 1'ПК. Риг 'гб Э'гент!мгфо1геггг г мыл фггегментл двгнитевой ДИК ме ген ного 1 пп б -г.онггг олнпи нз лиген (млтричнои).
е — псхпдныи фрегмент ДНК, обрвбетвнным ДНК.ыое 1: б — фрагмент ДНК, обрпбегвнным ДНКвзои 1 в приветствии РНК-попимерввы (денные А. <'ппссвагп) 7.17. АФФИИПАЯ МОДИФИКАЦИЯ ВИОПОЛИМЕРОВ Как уже неоднократно отмечалось, фундаментальным свойством белков и нуклеиновых кислот является их способность узнавать определенные низкомоле. кулярные соединения или другие пелимеры. Результатом узнавания является образование стабильных комплексов с этими лигандами. Обычно это не приводит н изменениям химической структуры биополимера и позволяет неоднократно испольэовать эти же молекулы биополимера, если это узнавание влечет за собой какие-либо биологические последствия.
В то же время отсутствие каких-либо химических последствий означает, как правило, отсутствие каких-либо следов пребывания биополимера в виде комплекса с соответствующим лигандом. Между тем во многих случаях желательно, чтобы такой след остался для определения области биополимера, принимавшей участие в узнавании. В некоторых случаях желательно сделать это узнавание необратимым для того, чтобы повредить бисм полимер с соответствующими биологическими последствиями.
Обе эти проблемы Решаются благодаря подходу, известному как аффиихад жодификаиия (или аффиииее .иечеиие). Узнавание основывается на взаимодействии нескольких центров биополимера со специфичным лигандом. Тем не менее в большинстве случаев в лиганде могут быть найдены некоторые центры, которые либо вообще пе участвуют в образовании комплекса, либо их изменение существенно не влияет па стабильность комплекса. Эти центры могут быть использованы для присоединения реакционно- способных остатков к лигандам без существенного изменения способности образовывать комплекс с биополимером., Внутри такого комплекса реакционно- способная группировка может оказаться сближенной с определенным остатком биополимера и в дальнейшем ковалентно связаться с реагептом.
Следовательно, мимическая модификация происходит либо в сайте узнавания, либо в близлежащей области биополимера. Так как эта реакция протекает вследствие сродства (аффинности) лиганда к биополпмеру, то этот процесс называют аффинной модификацией. Процесс позволяет ввести радиоактивные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки в определенную область бнополпмера. В случае белков не существует разработанных общих принципов конструирования лигандов, специфичных к определенным областям белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
