Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Трудности возникают в тех случаях, когда в качестве лиганда, несущего реакционноспособную группу, берется полимер. Иаприлсер, при изучении локализации транспортных РИК на рибосомах илн на субъедсиницах аминоацил гРНК-сиптетаз возмоясно использование реакцнопноспособпых производных тРНК. Присоединение молекул, несущих большой отрицательный зарлд, может привести к сильному изменению положения модифицированного белка в используемой системе разделения. Следовательно, прежде чем проводить разделение, необходимо удалить специфпческусо макромолекулярную часть из модиФицированного материала без разрушения связи метки с соответствующей субьединицей.
Задачи О О !1 гх И- Р-Π— гАТ-Π— Р ОС1Т 1 О О Вгснз ! С=О 0 ! ц Нн-сн-сня-О-Р-О-СН, ! ! СН, ΠΠ— Р— О-г(7 †Π†Р-67 ! О" -Π— Р-О-бт-о — РМ~О-бт 11 1 О О л 4 ) тРНК гл содср амт в 8 ом положении урвдин модифицированный НлслнгСОСНг -груипу ',е — — л5) Вг Сня-С СН (эз б ) Сьснзснз, О '. ©>-,),-~ )г(Н-СН-С~ .Л " *1.";"'~43" О 0 ННз О и чрев О О г О Р-О-СН, Х-0 О--О- Рис. 96. Расположение активных центггггв между о- и /Асубъелиггицзмгг фенилзланил-тР1!К сннтетазы из Алга!г Из-за маленького количества кагкдой фракции чувстшгтельность долгкка быть на уровне радиоактивного нли флуоресцентного метода.
1(рн использовании полимерного лиганда, который необходимо удаллть, надо, чтобы метка находилась в самой реакцнонноснособной группе, а не в уд знаемой полимерной части аффинного реагента. Приведем в качестве прилгера расиределеиие активных центров между о- н Ф субъединицами фенгглалацил-тр)1К сггггтетазы из Есо(г' (рнс. 96). Этот фермент „1г)ге катвлизирует связывание фенилюггагггггга с тр(! К и ирцсутстшш АИПР в качестве донора энергии (см. 8' 5.6). В качестве промгжуточного сосдггнения образуетгг' фенилаланиладеннлат.
Из рнс. 96 видно, что фоторсакцнонносно«обиый и-азцгюфенилаланин, аналог феинлаланнна, модпфнцнругт о-субьедшгггцу. Лденознн г триметафосфат, аналог АТР, и Х-броиацотнлфенгглалгшнладгчншат, аналог кро межуточного соединения, модифншгруют как о-, таь и ))-субг,едшгггггу. Это овна чает, что соответствующие активные центры локглгггггугогсгг в области контщгт" 884 субъединиц, позволяя реагентам атаковать обе субъеднницы. 11ронзводныг* тр!)Е, содержащие фотореактивные азцдогруины внутри остатка тр11К (тр!)Е.
обработанная ИзСзйгСОСИ Вг, чтобы прошгкгшнровать остаток тноурцднка но нолонгеишо 8), и Умо-бРомацетгглфеиилаланнл г!'1)Е (ИгСИгСИ вЂ” Р1ге — г!СС!) модифггцггРовалн /3- субъединицу. Однако аггазогггчггоо производное„но с сугцсственно большим !геакционноспособным остатком, ирнсоедннсицым к о-ХИг-гругггго, — хлорамбуцилил-Рйе — Ы(г~Ар — (С!СИ СИз) И вЂ” Сайг — (Сйг)з — С(6) — !Иге — ьйгхг! — моднфшцгруот главным образом о-субъеггггггггггу.
Это означает, что остаток тр!1Е с ирисоедггнснным фенилаланином локализуется иа ()-субъедцнице, но 0е слишком далеко от грвиггцы субъединицы, гшзволнн таким обргщоы длшшому остатку достш путь о-субьединицы. 7.1. Синтез ряда производных олигонушюотндов щюводят, актнвируя кощгсвой 5 '- фосфат имидаэолом. В ходе получения !'-нлшдзэслнда образуется побочный продукт — днэамещенный нирофосфат: Иа рис. 97 приведен гцюфиль элгоции полученной рвакшкннкгй смеси нрн аниоиообмокной хРоматографии.
Определите, какому соедннсншо соотггг"гстггует кажный»ик, и оцените выход основного продукта реакции. Количество вещества, вышедшего с колонки, пропорционально нлощадн ника, которая Рассчитывается как произведгщие высоты на ншрину на нолувысотг пика. 7.2. Для определения молярного кох)к1гшнкжта ногло«гпшн ггксадекануклеотид рг)(Т вЂ” С А-С вЂ” С вЂ” С вЂ” Т вЂ” (' — '1' — Т вЂ” С-С-С вЂ” г( Т Т) был нолвсрпгю гголному ферлкзпапгююиу гидролнзу до нукзсо щлогл Оптическая плотность распгор» олипнглшюотнла ло пггйюлнза цри длине волны 260 нм быгга 1,5030, после гн.'Июлиза в той же кювете оиа составила ! 8585. Определите молярный когффнциент несло!ценна ори 260 нлг для лашюго олнгонуклеотида, если молярные кож1гфшшскты ноглозгешгя для нукзсогшлон цри 260 нм следующгге (М ! см г): з = 15 4,!Оз..- — 7 4 !Ог, г = 115 10г; з = 8 7.10з А '' ' С ' ' С ' ' Т 73 Для выделения энлонуклеазы рестрикции ИТа)(1, узнающей последователыюсть ССАТС— иснользовали аффинную хроматографию.
С этой вещью к полимерному нос осителю был коввлентно ггггггсослннгн чегкз 5 '-ггоггггсггуггг фоп)атнло группу один из о ю ю ю ю пю ио ноню лю кю ю Рнс. 97. Профиль злюдии реакционной смеси, полученной при синтезе Р-ими- дазолида б(рТРТ) при анионообменной хро- матографии кю лоо лою лзоо и Рис. 98. Профиль злюции с аффинного сорбента опигонуклеотида П прн элюировании 3 моль/л раствором мочевинм олигонуклеотидов дуплекса, а именно рТТССАТСАСССАТСТТ (1).
При добавленпи комплементарного олигонуклеотида рААСАТСССТСЛТССЛА (11) происходит образование комплекса и формируется сайт узнавания для рестриктазы. Для аффинной колонки предварительно определяют емкость по сорбируемому олигопуклсотиду (единица оптпческол! плотности— о.е. — соответствует количеству поглощавшего вещества, которое, будучи растворено в 1 мл растворителя в кювете с толщиной слоя 1 см, дает величину оптической плотности !). Для этого на колонну, содержащую 15 мг афб>ллнного сорбента, наносят 3 о.е. второго олигонуклеотида в условиях образования дуплекса.
!<олопку промывают ЗМ мочевипой (денатурирующие условия), комплекс разрушается, и весь связавшийся олигонуклеотид элюируется с колонки. На рнс. 98 представлена хроматограмма. Нзвсстно, что скорость движения бумажной ленты 2 чм/мин, скорость олюции 50 мкл/липс Рассчитайте количество связавшегосл олигонуклсотида и емкость сорбснта. 7.4. Для исследования химической модификации ДПК в составе хроматика используют меченый [ ° 1-олигонуклеотид, содержащий на концеволл фосфате злкнлируюшую группу. гззР1 Какова должна быть удельная активность меченого олнгонуклеотида, чтобы можно было детектировать модифнкацик 0,1 о.е.
Д!П< (г = 7 !О'М 'см' нуклготид), если известно, что степень модификации (отношенне количества реагснта к когш к ству пуклеотидов в ДНК) не ниже !О . Для модификации испольэовали пропзьолнос гскгадекатиипдплата -с! (рйТ)го (г = 155 ° 10зМ 'сллч). Э4лфективность света 40луо, фоп счетчика 20 импульсов в минуту.
Счет образца должен превышать фон не меньше чем в !О раз. 7.5. Для диагностирования инфаркта миокарда определплп концентрацию миоглоблпла в сыворотке крови трех паппснтов с использованием'антител, соде!лхгллшпх флуоресцентную метку (комплекс Ец ). Фчуаресцепцлпо измеряли ка флуоримстре, работающем к,лк счет- и чии фотонов. Предварительно была измерена флуорссцснцпя для образцов, содержащих известное количество миоглобпна, получены следующие результаты: 336 5057 Постройте калибровочную кривую в логарифмических координатах и определите концентрацию миоглобина в сыворотке крови пациентов, если были получены следующие относительные интенсивности флуоресценции: 31 844, 79 763, 608 174.
7.6. Для определения аминокислотной последовательности рибосомальный белок ЬЗ2 был расщеплен на фрагменты двумл различными методами (А, Б) и для получекных фрагментов методом Эдмана была определена первичная структура. Для метода А получены 12 фрагментов: 1. САЕ1АНХУНБК!ЧВКЛ1УЕВАА()ЬАТВУЧ 2. ЬЧННУКЕЬЕУЬЬИСИКЯУ 3. ИААЬИРЬУКРК1УККИ 4. ВКРВС19%УВККГ 5. НРХАВЬВБЕЕХЕ 6. КСН1ЬИРНТСУ 7. КМИЬРНСГ 8.
1ВНННОКУ 9. ЧК1КВИН 10. С$%КЧ 11. ВКГ 12. ККГ Для метода Б получено 4 4лрагмента: 1. МААЬВРЬЧКРК1ЧККРЧККГТВН()ЕНВУЧК1КВ!ЧНВКРВС10%УВВВГКС()1ЬМ 2. С%5УСАЕ1АННУББК%КАТЧЕВАА()ЬА1ВЧЧХРИАВЬВЯЕЕХЕ 3. ЬРЕСГНКГЬУННУКЕ!,ЕЧЬЫ 4. РХ1СУСЯ%КЧКНМ С помощью каких методов было проведено расщепление белка? Воспроизведите аминокислотную последовательность рибосомального белка ЬЗ2, исходя из двух наборов фра~ ментов, полученных разными методами. Сколько пептидпых фрагментов будет получено, если белок подвергнуть расщеплению гидролитическим ферментом трнпсином? 7.7. Определение молекулярной массы фермента фен~илаланик-тРН(<-синтегазы из ГЛепаию !ЛегоюрЛЛ!из проводили двумя методами: гель-фильтрацией на декстрановом геле ЯерЛасгу)-5-300 шведской фирмы ч!л)~алчзас!аЪ и гель-злектрофорезом на почи' акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
