Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 84
Текст из файла (страница 84)
Поэтому конструирование реагентов для аффннной модггфикациги белков чаще всего основывается на знании их специфических лпгандов. Таким образом получают производные или аналоги соответствующих субстратов для аффинной модификации каталитических центров ферментов. Также используют аналоги эффектоРов для модификации регуляторных центров ферментов. Аналогии прозводные гормонов и нейромедиторов, снабженные реакционноспособными группами, "Рименяют для аффинного мечепия соответствующих рецепторов, как, например, Реакционноспособные производные и аналоги АТФ, представленные ниже, ко- торые были использованы для аффинной модификации АТФ спнтазы (см. 1 8.5). 2И 2т = Н 2д та Нв О СНгСНТСО НОг УА=РРР 3'-0-[Н(2-нитро-4-азидофенил)-Д-аланил)-АТР г,=г,=г,=г, г,=ггг,— С© — г(В— 5'-и-фторсульфонил бензоил аденозил 2 = Н 2зж2 =Н, 2 =РРР 2-азидо-АТФ 2 = Н, 2т = Ня, 2 = Н, 2 = РРР 8-азидо-АТФ Выло найдено, что все эти соединения, первые три — при облучении УФ-светом, осуществляют аффинное мечение фермента из разных биологических объектов.
Для аффинной модификации ферментов используют тип реагентов, названных суицидными (реагенты-самоубийцы). Эти соединения сами по себе инертны п и при мягких условиях, но прн воздействии фермента превращаются в реакционно- способный интермедиат, который может вызывать аффпнцую модификацию. Например, известно, что О-гидроксиацил-СОА под действием фермента О-гидроксидеканоил-АСР гидролазы (3-гидроксидеканоил-(ацилпереносящий белок)дегидратаза ЕС 4.2.1.60) превращается в О,у-еиоил-СОА в результате промежуточного отщепления протона О-Н+ по уравнению К-СгС вЂ” СНт-С(0)-ЯК ' -+ [1РС~-СН вЂ” С(0)-КК '~ — — я -+ К-СО=С=ОН-С(0)-ЯК ' -в К-СН=С вЂ” СН -С(0) — КК ' ! (УП.29) Еп2 В отличие от белков для нуклеиновых кислот как минимум в двух случаях можно подобрать структуру, специфически взаимодействующую с произвольным участком иуклеиновой кислоты.
Это, во-первых, участки однонитевых нуклеиновых кислот в областях, где они пе образуют сложной пространственной структу- 330 я К СНг ыг)КОНОН!С(0) АСР -г [К СНтСНОНСН С(0) АСР| -г г К СНлСНаСНС(О) АСР + ОН (У11.28) Сходные по структуре,8,1-ацетиленовые тиоэфиры узнаются тем же ферментом. Но в этом случае отщепление протона приводит к образованию конъюгированного аллена, который легко алкилнрует гистидиновый остаток, находящийся в активном центре фермента: 12 34 в ° гв ° ЯВ ЮВ ° ВВ даоыг структур может принести к подавлению биологической функции соответствующей нуклеиновой кислоты-мишени, в связи с чем на них возлагаются большие надежды как на потенциальные противовирусные и противоопухолевые средства (в частности, в связи с проблемой СПИДа).
Развитие таких подходов стало в последнее время одной из наиболее бурно развивающихся областей биотехнологии. Одним из вариантов применения антисмысловых подходов является аффинная модификация нуклеиновых кислот. Поскольку принципы формирования двуспиральных и трехспиральных структур в настоящее время хорошо известны, не представляет труда выбрать в олигонуклеотидах точки, несулцественные для образования таких структур. Например, присоединение реакциоп фосфату не должно приводить к нарушени! поскольку эти взаимодействия обусловлены в о связей между гетероциклическими фрагментам иоспособнык !рупп по концевому о взаимодействий между цепями, сновном образованием водородных и.
Более тосо, как видно из рис. 33! ры, например шпилек или псевдоузлов. Б этом случае такой участок будет узнаваться комплемеитарным олигопуклеотидом или комплементарным участком нуклеицовой кислоты. Кроме того, если в составе двунитевой нуклеииовой кислоты ил!естся фраглгепт, одна нить котОрогО сОстоит то!!ько из пирггмидиновых нуклеотидов, а вторая соответственно только из пуриновых, то, как указывалось в К 3.7, можно подобрать соответствующий пиримидииовый олнгонуклеотид, который может образовать тройной комплекс с двуспиральным участком.
Более того, после того как для нуклеиновых кислот были развиты меплды селекции гд цг1го, открылась перспектива поиска для фрагментов нуклеиновых кислот со сложной пространственной структурой соответствующих аптамеров с достаточно высоким сродством к такой структуре. Олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты, способные взаимодействовать с определенными, имеющими биологический смысл участками нуклеиновой кислоты, называют апти- смысловыми. Использование таких акшисжис- ~е А а® С Рис. 05.
Электрафарегряммя ряякциаккы( !метай дасл! Иадифилгцик ял кггтгирую!ними праизвадиыыи 303- лвянкага адиацепалелнага фрягыактя ДНК Реакциаккяя смесь абрябятыввласв липеридикач для ряс!!ге!аления ДНК ла тачкам алкилиравяния: I, Х 4 — лрадлкты дегрядяцкк фрягмеата ДИК, лаву !вялые после ялкклиравяккя реагеятяыя П, С и А! 3 — лрадукты деградация фрагмектя ДИК ла лурякавыы куклеаткдаы (маркер дяя алредялекия лалажляяе рясцгяллеккя) 26, введение заместителей, в том числе реакционпоспособпых групп, в 5-положе ние пиримидииоаых гетероциклов не должно нарушать комплемептариые вза имодействия в даун>стевых структурах.
Определение модифицированного остатка внутри бпополпмера с известно>с первичной структурой является коне шой и наиболее трудоемкой стадией эксперимента. Обычным способом определения (локалпзацип) людиф>сциронаппого остатка в белке является первоначально фермеитатпвиое пли химическое расщепление биополимера на небольшие пептидные фрагменты, разделение их методом злектрофореза, изоэлектрическим фокусированием илн хроматографнчески и идентификация модифицированного пептида. Идептификацшо провести достаточно легко, так как модифицированный пептид смещается относительно пемодифицированного в стандартной системе разделения Далее может быть проведена процедура ступенчатой деградации по Эдл>ану до тех пор, пока па одной из ступеней ие образуется фенилтпогидантопновое производное с характерпстшсой, например хроматографической подвижностью, не свойственной фепилтиогидантоинам известных аминокислотных производных.
Этот подход не всегда приводит к желаелюму результату из-за различных осложнений: многообразие модифицированных сайтов, обусловленное подвижностью первоначалысого комплекса белка с реагепточ, приводящей к неоднозначной фиксации реагента на белке-мишени, нестабильность продукта людификации на стадии разделения или деградации по Эдману и др. Локализация сайтов модификации в нуклепнош,>х кислотах обычно проводится методом, сходным с теч, который применяется прп секвс>с»ровашссс Д!! К методом Максама — Гилберта. Иуклш>новая кислота (мс>шспь) четптся с>Р по одпочу из концов. После аффпкпой модификации реакцнонноспособныч производным антисмыслового олшопуклеотпда млшепь обрабатывантг ткк, чтобы разрушссть межнуклеотидную связь в людпфшпсровапноч санте. Иа радпоавтографс, полученном после злектрофоретпческого разделения, появляются полосы, соответствующие фрагментам мишени, расположенным между "-р-меченным концом и точкой расщепления.
Положение полосы соответствует длине фрагмента н, следовательно, указывает на расстояние между точкой распсеплеш>я п чочепым концом и тем самым указывает на положение модифицированного остатка. И качестве примера на рис. 95 представлены результаты аффпппого алкплпроваппя одпоцепочечной ДНК, состоящей из 303 нуклеотпдов. Для а>п.плп!юаашш испольэовали следующие реагенты: д(АрсрсрСВТИСРТИТРСРСрср)гА з СИИС1 л С1ИСИ>ннрс!(АрСрСрСрТрСрТрТрСрСрСр)г! В 61ИСИ>ИИ6(СрСИТрсрТВТрсрсрср)гА С где ИС1 — р-(И-2-хлорами>сл-И-лсетл>ламп>>о)фе>с>с>с — остаток.
образующий выс реакционноспособный промежуточный этнлепаччоппевый катион, который а> пирует нуклеофильный центр мпшепп, преимущественно гуаппцы по 37-пол нию в соответствии со схелюй 332 СИ>СИ>61 Снг +ВИА Х О вЂ” Х О Й ! ~сн ~' сн, СИ> — лХ О И СИ!СИ> 0 1 сн [! (711.30) ИИ где Х вЂ” олигонуклеотид со спейсером, соединяющим йс! с олигонуклеотидом. Участок мишени, по которому проходила модификация, имел структуру — с)(срсрТрсрСрсрТрТрсрАрАрТрсрсрсрАрАрсрАрсрСрсрТрсрАрсрсрТИТрсрс)— 1 1 1 1 250 260 270 280 (номера указывают расположение нуклеотидных остатков во фрагменте ДИК). Олигонуклеотиды, составляющие вьппеуказанные реагенты, образуют комплементарные комплексы с нуклеотидамн 261-27Л (А и В) или 261-270 (С) мишени. Как видно из рис.
95, реагент А с реакциопноспособной группой, присоединенной к аденозину, образующему Уотсон-Криковскую пару с основанием 261, алкилирует цреимуществеино С-258; реагепт с группой, присоединенной к рс1С, образующий пару с 6-275. модифицирует главным образом этот же гуанин; реагент С с группой на рбс, взаимодействующей с 6-270, большей часть алкилирует 0-271 и 6-272. Во всех этих трех случаях реакция протекает избирательно в той области, где находится реакционноспособная группа. При изучении субъединичных белков и нуклеопротеидов аффинная модификация дает возможность понять, какие субъединицы участвуют в узнавании специфических лигандов. Эта проблема существенно проще, чем точная локализация точек модификации.
Субъединицы как белков, так и нуклеиновых кислот обычно идентифицируются в соответствии с их положением на хроматограмме, злектрофореграмме, при изоэлектрическом фокусировании в завнсилюсти от выбранной системы деленил. Прпсоедцпение метки обычно не изменяет существенно положение макромолекулы в таких системах. Следовательно, проблема заключается в том, чтобы обнаружить среди разделенных субъединиц ту, которая содержит введенную метку.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
