Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 77
Текст из файла (страница 77)
'.се .. 84. Схема встраивания гена в кольцевукс плязл<иду; < — арелряи<еиие иопьссеьон ппюмнды я пииеииую дяуннте»ую ДНК с пнпинмн концимн< .*' — обри аляине иоыопеися <инеи — нои олязындиои ДНК и ьстряняяемага геня в виде яапьиеяон стртиттрь< с дить<я никами; 3 — обрс<батия абрсюьялщегаси коыапехся ДНК-<ига<ой; 4 — образо»«ине пиниях концов с полющья> тернии;юлиан дезоясииуяпеатнднпт<я итферязы » геня я просу<стяни дЦТФ и т ппязыиднои ДНК» присутствии дГТФ; д — тяс ю< .: б ,«иью ДНЛ-попимерязы !» присутствии всех четырех ДНЛ< о — пниансощия инка» с оочощью ДНК- <нг аы с образованием 3'-оксигруппы и 5"-копцевого фосфата.
Это расщепление происходит в гене, ответственном за устойчивость к амиициллнп '. Об липу. Разующаяся линейная ДНК им й ДНК ест так называемые липкие концы, т.е. выступающие с обеих сторон двунитевой структуры одпонитевые фрагменты 4(РТРСРСРА)4)П. По этим 302 концам может присоединиться олиго- или полииуклеотпд, имеющ Ъ ш комплемеп- тарную п сл о едовательпость пуклеотидов, которая в данном случае (это вообще типично для эпдонукл онуклеаз рестрикции) ипдеитичпа липкил< концам плазмидиой ДНК. Т ю последовательность может содермсать иа копнах встраиваемый двуаку нитевой ген, если он получен путел< химико-ферлкитативиого синтеза, в ходе которо го предусмотрены такие коиструкц<ш, или доу<штевой геи, вырезанный из молекулы ДНК с полющью той все эпдоиуклоазы Рис1.
13 этом случае возможно образование комплекса линейной плазмидиой ДПК и встраиваемого гоп<а в виде кольцевой структуры с двумя никами (рис. 84), который при последующей обработке ДНК-лигазой в присутств<ш донора адеиилатн (см. з' 5 4) превращается в замкнутую двунитевую ДНК, содержащую встроенный ген, Если у гена липкие концы ну>киото строения отсутствуют, то можно их искусственно создать. Удобпь<л< для этой цели ферментах< являетсл таержвналы<ая с)езохсинуклеотиди>< тораигферази (выделяомал из вилочковой железы телят), котор ая катализирует безматричиый перенос дезокгииунлсотидиых остатков от дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов иа 3'-концевую ш<дроксигруипу олиго- или полидезоксинуклеоти>сов, Как видно из рис.
84, такие концы можно получить, обрабатывая плазмидиую ДПК трапсферазой в присутствии АГГ<!>, а встраиваемый геп — тем же фермоитом в присутствии дЦТс!>. Слипаиие гена и плазлшды происх оисходит за счет комплемеитариых олигодсэоксигуяпнловых и олпгодезоксиц нтидиловых послсдоввтельиоскй, причем образуется кольцевая структура с брешами в каждой пити. Эти бреши могут быть застроены с помощью ДПК-полимеразы 1 в присутствии смеси всех чстырех дП'1'Ф. После этого инки ликвидируются с помощью ДПК->сигани.
Образование кольцевои плазмиды со встроеипь>м геном в ходе. описанных обработок отнюдь не является количественной процедурой. Часть линейных молекул может вообще ие образовать никаких кольцовых структур, другая часть-- образовать структуры без встраивания дополнительного гсиа; могут также образоваться комплексы двух или более плазмидпых 4 и х.с. " у Г ' т.. Поэтом необходим отбо плазмид, содержащих дополнительный геи. Этот отбор проводится в ходе Р процедуры, известной под названием лмоиирооаиид Этой процедуре предшествует введение полученной смеси ДПК и бнктсршщьпые клетки, которые сделаны ироницаемыми для двупитевых ДПК путем специальной обработки, паприлкр растворами солей кальция или рубидия.
!3 результате получается гетерогенная популяция бактериальных клеток, некоторая, сряви<ггсльпо небольшая часть которых соде жит плазмиды со встроенным гевал<. Задачей клонирования является отбор Р именно этих клеток. Суть клонировашш состоит в том, что из к;ш,дой клетки по отдельности выращивается популяция клеток, имщ<уемая клопом.
В отлично от исходной популяции каждый клон гомогенеи, т.е. либо все его клетки содер>кат плазмиду со встроенным геном, либо все ее ие содер>кат. 'Гехника клонирования достаточно Разнообразна, и ниже будет излагаться одна из типовых схем. Очевидно, что в рассматриваемом случае нунсио отобрать те клетки, в которые проникли плазмиды со встрооипь<м геном. Такие клетки должны сохранить способность расти <ш среде, содержи<цей тетрацшслии, геи которого остался неповрежденным, и утерять способность расти иа среде, соде р хшцей ампициллин, поскольку его ген испорчен введенной вставкой.
Поэтому разбавленную суспензию клеток, обработанную описанной смесью ДПК, наносят ин плоские чашки, в кото ые залит агаровый гель, содержа<ций все комиоиснты, необходимые для рые зйя размножения бактерий, и антибиотик тетрациклин. Из каждой клетки, содер жащей плазмиду, на такой среде вырастает популяция клеток, именуемая клоном Из клеток, лишенных плазмпды, на этой среде клоны пе вырастут, так как они лишены защитного механизма для обезвреживания теграцпклина.
Следующей задачей является отбор тех клонов, в которые произошла встройка гена. Для этого каждый клон проверяют на способность расти на среде, содержащей ампициллин, и отбирают те клоны, которые на такой среде пе растут, т.е. у которых ген, ответственный за устойчивость к этому антибиотику, отсутствует. Это и есть клоны, у которых в пределах гена устойчивости к ампицнллпну произошла встройка дополнптельного генетического материала. После отбора клонов со встроенным геном можно размцо кпть клетки этого клона в достаточном количестве, выделить из нпх плазмидную ДПК п с помощью той же рестрпктазы е:выре- зать> размноженный ген.
Если ген нужен для производства программируемого нм белка, то с помощью аналогичных приемов его встраивают в специальным образом сконструированные плазмиды, в которых гец примыкает к эффективно работающему промотору РНК-полимеразы. Прн введении таких плаэьшд в соответствующие клетки последние начнут интенсивно нарабатывать информационную РПК, соответствующую этому гену, а с ее помощью и конечный продукт гена — белок.
Векторы, используемые для этой цели, называют зкслрессарующижи. Отбор клеток, которые зкспрессируют встроенный ген, лучше всего вести непосредственно по накоплению продукта экспресспи в клопах, например используя !задцоиммуноаналнз или иммуноферментный анализ с мечеными антптеламп к продуцпруелюму геном белку. Нередко возникает задача цвести гоп в клетки эукарнот, например в дрозкжевые клетки, в которых могут парабатываться белки, прошедшие после их образования необходимые стадии модификации, несвойственные прокариотнческим клеткам. Для этой цели используют специельпые, так называемые челночные, векторы, которые могут автономно разлшоя аться как в прокарпотическпх, так и в зукариотическпх клетках, например в Е.со! 1 и дрозхжах. В эукариотпческие клетки плазмиды вводят па заключительных стадиях, поскольку многие предварительные этапы клонирования существенно проще проводить в клетках прокариот.
Главным условием автономной реплцкацин является нцпнчце в составе плазмиды участков ог), т.е. области начала реплпкацни. Этн участки резко отличаются у прокариот и эукариот. Поэтому челночный вектор должен содержать два таких участка. Если гены получаются в виде фрагментов хромосомной ДПК или в виде комплементарной ДНК, то в подавляющем большинство случаев первоначально в руках исследователя оказывается чрезвычайно сложпал смесь. '1'ак, общепринятый метод выделения информационных РПК эукарпот основан ца наличии па 3'- конце этих РНК полиаденпловых фраглеентов (см. 5' 5.6).
Такие мРПК задерзкнв ются на аффинных сорбентах, содержащих пммобилнзованпую полиуридилову кислоту или синтетические олнготпмидплаты, в результате комплементарны взаимодействий последних с поли(А) участкьмп мРПК. При осуществлении обра ной транскрипции получается смесь коьпшелзептарпых ДН1( (кДПК), соответств ющих всему набору мРПК, выделенному пз исходной биол~ассы. После создания полученных кДПК липких копцов осуществляется их встраивание какой-либо вектор, например в плазмиду рй)1322. В итоге у-~ + получается сложная смесь ~Д + векторых молекул, содерзкащих весь набор кДНК.
Такие смеси в генетической инженерии называют биб- е н1 лиотеками, в данном случае библиотекой хДНК. Для нахождения нужного гена в такой библиотеке также ~+ О используется процедура Е ч ! клонирования. В этом случае после выращивания клонов отбирают те из них, которые рис. дб. Охом» спитспецифичпого мут»гекезз.
производят продукт искомо- à — естрлпьккпе гена е деукитееую реплик»нп»кню форму го гена. Отбор может быть днк фкт Ы!з <гбузпрз); '. — обрезок»»не зрелых юстиц ПРОВЕДЕН С ПОМОЩЬЮ ИМ- ф»ге. содерпюцих одкопктееую «ольцевпо молекнпн ДНК мунохимнческих методов (плюскзепь); з — сккгез ми»ус-цепк с копель»ею»пзем изме-, не»кого прлпмер», содер к»щего кодируюшип злеыект з»меЕсли имеется информация о кпеыап кцккокпспозы; б — абрлзоеккке юмккуток реплпкк- пврвичной структуре какого- тцепоп формы, содержзсцек зкпленкроеенную ыьткцию: 5— либо достаточно протяжен- в»окские ее е бкктеризлькню клетку и произеодстео паосного участка гена, то отбор пепел, песушкх мутацию ц ьыбрепкоы ските клонов можно проводить с помощью метода молекулярной гибридизации, пользуясь соответствующими синтетическими олнгопукпеотндпыми зондами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
