Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Анализируя спектры каждой полосы, проходящей через регистрирующее устройство, можно сразу определить, какому красителю, а следовательно, какому нуплеотиду эта полоса соответствует, т.е. проводить определение последовательности на одной дорожке вместо четырех. В сочетании с достаточно мощными ЭВМ, обеспечивающими быструю обработку спектральных данных, поступающих с большого числа дорожек геля, можно одновременно анализировать много образцов.
Этот подход положен в основу создания техники, позволяющей на одном приборе определять последовательности нескольких сотен тысяч нуклеотидов в течение суток. Такие темпы стали весьма актуальны в связи с уже ведущимися работами по установлению полной первичной структуры ДНК всех хромосом человека (структуры генома человека), которые содержат несколько миллиардов пар нуклеотидов. 7.9. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ Химический синтез полипептидов и белков имеет большое теоретическое и практическое применение. Пептидные модели широко используются длн изучения белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий.
Некоторые гормоны являются пептидами и необходимы в больших количествах для медицинских целей. Некоторые из них, а именна инсулин и вазопрессин, были описаны в 1 2.1. Огромный интерес к синтетическим пептидам возник, когда открыли большую группу пептидов мозга. Первыми были открыты метионин-энкефалин Туг-п)1у-61у-РЬе — йес и лейцин-энкефапин Туг — 61уь1у — РЬс — 1сп.
Эти два пептида связываются с теми же мозговыми рецепторами, что и опиаты, например морфин. Таким образом, их можно использовать вместо морфина в качестве анальгетика. Основное достоинство этих пептидов заключается в том, что опасность привыкания к ним существенно ниже, чем к марфину. Традиционная синтетическая макромолекулярная химия обычно имеет дело с получением гомополимеров, построенных из однотипных мономерных единиц по всей цепи, Разработаны методы, позволяющие получать тысячи и миллионы тонн многих полимеров.
Те же технологии позволяют в случае необходимости получать сополимеры, состоящие из двух (или более) сходных типов мономеров со статистическим распределением их по цепи. В частности, возможно получение гомополимеров или статистических саполимеров, состоящих из аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями (полиаминокислот). ОбЩей проблемой как при получении полиаминокислот, так и в синтезе нерегулярных полипептидов является образование пептидной связи. Если речь идет об образовании пептидной связи из аминокислот, то предварительно их надо прев- 283 103 (УП.21) + г НС1 (а.1Р) 2ксоо-+ дцк(~~ (кс(а)1,0+.Дцм +Н' КСОО + НОХ вЂ” ч КС(0)ОХ + ДЦМ к с(о) о с н но 104 к — с(0) — 0 — 0665 105 К вЂ” С(0) — 0 106 Х вЂ” С(О) — а — М' г 107 ратить в активные производные.
Это необходимо по крайней мере по двум при чинам. Во-первых, образование пептндной связи в водном растворе неблагопри ятно с точки зрения термодинамики, так как ее еХС6 > О. Соответственно этот процесс необходимо совместить с экзэргоническим процессом с ЬС6 < О, с тем чтобы суммарное значение Ь С было близко к нулю, а еще лучше — превосходило по абсолютной величине значение ЬС образования пептидной связи. Во-вторых, и карбоксильная и аминогруппа являются нуклеофилами, так что прямое взаимодействие между ними неблагоприятно с кинетической точки зрения.
Обе проблемы обычно решаются одновременно, так как превращение одной из функциональных групп аминокислот, чаще всего карбоксильной группы, в электрофильиое производное не только снимает кинетические затруднения, но проходит сопряженно с процессом, характеризующимся отрицательным значением Ь С, сообщая аминокислоте необходимое для образования пептидной связи количество свободной энергии. В качестве примера можно привести процесс получения полиаминокислот, основанный на конденсации Ф-харбоксзангвдридов ажииохисяош (102), образуемых из соответствующих аминокислот обработкой фосгеном: СНЯ; йН-СНй СОО- + СОС1 Н~ сО е э / СΠ— О 102 Эти соединения содержат злектрофильную ангидридную группу, которая может атаковать алифатическую аминогруппу аминокислоты, используемой в качестве затравки, с выделением Соэ и одновременным освобождением новой аминогруппы из атакующей молекулы Н-карбокснангндрида.
Это создает условие для проведения реакции со следующей молекулой Н-карбоксиангидрнда, таким образом открывая возможность продолжения поликонденсации: НН вЂ” СНК,— С=Э + 11нэ — СНК,СОΠ— 6 Я1д-СНК;-С(О)-НН-СНИ-,СОО + Сот — 6 102 ~с — о~ !! 0 — + 1ЧН;-СНК;.-С(0)-НН-СНК,.-С(0)-НИ~НИ;.-СОО + Сот — 6 ... (ХП.20) Нетрудно заметить, что с учетом реакции (УП.19) каждая стадия поликонденсации сопровождается превращением молекулы СОС1э в Сот и 2НС1, что термодинамически выгодно и является источником свободной энергии для образования пептидной связи. При синтезе нерегулярных полнпептидов используются другие методы активации карбоксильных групп. Большинство из них базируется на использовании Н,Н- дициклогекснлкарбодиимида (ДЦК).
Этот реагент, будучи добавленным в смесь карбоновой кислоты КСОО и амина Ннэн', способен осуществлять активацию кар боксильных групп еа эои по реакции КСОО- + С,ки — Н=С=~Х вЂ” С,Н„(Н'1 С " "" С=" С " Π— С(0) — К вЂ” С Н вЂ” НН вЂ” С вЂ” НН вЂ” С,Нп + К вЂ” С вЂ” Нн — К' Процесс протекает через высокореакционноспособное промежуточное соединение (103), представляющее собой о-ацил-Н,Н '-днциклогексилизомочевину. Термодина- мически движущей силой процесса является экзэргоническая гидратация ДЦК до дицнклогексилмочевнны (ДЦМ): С6Ни 5="С'ЦХ бабки + Нэо '6 Секи НН 'С НН СеНи !! 0 Обычно тем не менее в пептидном синтезе ДЦК используется не непосредственно, а для получения достаточно стабильных реакционноспособных производных аминокислот, ангидридов или активированных эфиров путем реакции с соответ- ствующими гидроксисоединениями: Будучи достаточно активными нуклеофилами, активированные эфиры (103) - (107) должны содержать сильный электронный акцептор Х.
В ряду разнообразных актнвированных эфиров необходимо отметить такие, как производные а-нитрофенола (104), пентафторфенола (105), Н-гидроксисукцинимида (106), Н-гидроксибензотриазола (107): Н пептидном синтезе также широко используются азиды аминокислот (108). Их легко получают последовательной обработкой эфиров аминокислот гидразином и азотистой кислотой; КС(0) — Осгнь — 6 КС(0) — ФПЬИэ — -6 КС(0) Мэ + '2нго 108 ДЦН + пМЮокоибеиаотриазол (1) ОбРаботка киопотой (2) нейтрализация (8» (СНэ)э С-Π— С(0) — ННСНСООН 1 СН С Н ОН СО ! СН3 С ОС(0) О 1 СНэ Туг- О(у-6»у-Рйе-Ме( 109 Тем не менее ни одно иа этих производных нельзя непосредственно использовать для синтеза пептидов определенной структуры. В самом деле, смешивая две аминокислоты с активированными карбоксильными группами, можно получить уже на первой стадии процесса образования четыре разных дипептида: ,ИИ,СНК,С(0) — МИСКИ,С(0) — ОХ ИНэСНК~С(0) — ОХ + ИНэСНК1С(0) — ОХ ~%ЬСНКэС(0) — ИИСУС(0) — ОХ 2ИНэСНК1С(0) ОХ + ИНэСНК10(0) ИНСИЦС(0) ОХ 2ИНзСИКэС(0) "ОХ вЂ” + ИН2СНКэС(0) "ИНСНКэС(0) ОХ Более того, каждый из этих дипептидов остается реакционноспособным, сохраняя одну из нуклеофильных аминогрупп и одну активированиую карбоксильную группу С(0) — ОХ.
Поэтому процесс не останавливается на стадии образования дипептида, а продолжаегсн дальше. Следовательно, в такой смеси можно получить только статистический сополимер. Для того чтобы обеспечить возможность образования только одного дипептида, необходимо предотвратить образование трех остальных. Очевидно, для того чтобы получить дипептид эаэСИК1С(0) — 'ИНСНКэСОО, необходимо исключить участие в процессе аминогруппы первой аминокислоты и активированной карбоксильной группы второй. В пептидиой химии это достигается использованием защитнмг сруаа Я на тех функциональных группах, которые не должны вступать в реакцию. Реакция Е1 — 5НСНК|СΠ— ОХ + ИНэСНКэС0 — Еэ — + Е1 — ИКСИИ~СΠ— ИНСНКэСΠ— Ез должна приводить к одному оцредсленному дипептиду.
Этот дипептид нереакционноспособен и для продолжения процесса необходимо удалить одну из групп Еь Ем для того чтобы открыть либо ИНэ-, либо СИОН-группу дли следующей стадии удлинения пептидной цепи. Главным требованием к защитным группам Е1 и Еэ является возможность их селективного удаления при достаточно мягких или специфических условиях, при которых не затрагиваются другие защитные группы и образованная пептидная связь.
Наиболее широко для защиты а-аминогрупн используется трет-бутилоксикарбонильная группа (Нос), которую легко ввести в аминогруппу обработкой аминокислоты соответствующим М-гидроксисукцинимидным эфиром: Эту группу можно удалить слабой кислотной обработкой пептида, при которо" пептидная связь не разрушается: (Снв»эс-Π— С(0)-ННСНСООН + Н НСНСООС Н ! ) сн с,н, сн,сн,зон, (»в -О-С(о» вЂ” (з + (О»- 4 (1) СНзсвна СН,СН,ЗОН, ф (Н» ф (з» (Снз»эс О-С(О»-ННСнзСООН+ НН,СН,-С(О» ННСН С(О» Н Ф (1) СНзСвНв СнгСН ЗСН ~ (Н» ф (з) нн,снз — с(о) — ннснэ-с(ОИО(сн-с(о)-ннснсооснз 1 Сна Св Нв СНа СНз ЗСНз (е) (Н) (з) ННзСН вЂ” С(О)-ННСН С(о) ННСН С(о» вЂ” ННСН вЂ” С(о» вЂ” Ннс~ СН,С,Н,ОН сн с н сн сн зсн обработка щелочью Рнс.
80. Схема синтеза пентапептида мсгионин-оиксфалина Продолжение табл 7 Продолжение табл. 7.6 290 Специфической особенностью полнпептпдного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи: образование новой пептпдной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгацпп цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и побочных продуктов после каждого химического превращения.
Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезпруемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептпдом, растущим на этой смоле Этзэт метод известен как тосрдофазнмй синтез полинснтидоо.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
