Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина - Биологическая химия (1128707), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Ою соединение способно встраиваться (ин Р ир в ть) в .дничн основаниями параллельно им и растягивать спираль, двойную спираль между сосе,' ченный неполноценный й неполноценный белокс с концевой последовательностью С1У вЂ” зе> — Уа) — А)а. Объас- ните результат. $А. Для транскрипции»н т1ЬГО В ПЛВЭМИЗЦ>, СОДЕРжаЮЩУЮ ПРОМОтОР фаГа Т7, бЫЛ встроен ген, геи фрагмент которсого, несужий т1нзнскрибируемую цепь с Участзюм пгюмОтОРВ, имеет последовательность $ -ССАСТССААСТТТСАТСТСТСССТАТАС-3'. Для синтеза ИРНК с этой ДНК к плазмидае была добавлена ДНК зависимая РНК-полимераэа фага Т?, АТФ, УТФ и ГТФ.
Напишит>е последовательность продукта транскрипции. $.$. Для синтеза пептида в бесклсточной прокариотической системе на МРНК с транс- лируемой последовательность ой последовательность>>о АБОБПСССАССБСССО'>1П в систему добавили полирнбо- сомы, н р амииоацнлирова м>ных тРНК, 1 Т'Ф, фа«торы инициации в фактор Тц. Что ии? юзтть нУклеотиднУю последовательность ДНК„чт ы, сохранив аминокислотную последоват исл<~гн щ>сле Свате>ЛЪКОСтв УДапнтЬ Саят УЗНаааНИЯ ЭНДОНУКЛЕазЫ РЕСтРНКЦНИ Ва>пнр считайте что первыР нувлеотид сайта Уэнанания совпадает с первым нуклеотидом колона Кэз,ю, методом это мсожно осУЩествить.
$7 В „„, п>лаэмнду встроен ген, в котором сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции цю, ЕООН1 нани Я с О, входвщего в тРиплст пеРвого мстионина ВстРойте в этот белок дополнительный тгрипептид. Какие огРаничения налагаются на строение этою трипептида? Уникальная активность и селективность действия ферментов стнмулировели интенсивные усилия, направленные на выяснение механизма их действия. Эта проблема складывается из двух главных аспектов: кинетического и структурного. Структурный аспект сводится к решению двух вопросов: 1) как ферменты узнают строго определенные субстраты; 2) как опи обеспечивают высокую скорость ферментативного процесса. Для этого необходпл>о было установить, как располо>кен субстрат на молекуле фермента, какие группы участвуют в его узнавании, и на этом основании предположить, как некоторые из этпх групп обеспечивают каталитический механизм протекания процесса. Наиболее существенная информация была получена методом ронтгепоструктурпого анализа, который в общих чертах описывается в 1 7.13.
Если для работы фермента требуется кофактор, то необходимо иметь данные о рас>юложепин па люлекуле фермента этого кофактора. В настоящее время изучено большое число ферментов. В этой главе детально рассмотрено несколько фермонтативных реакций, для которых такие исследования' уже проведены. Основополагающие законы кнпетпкн ферментативпых реакций были установлены уже в начале ХХ в. Было постулпровапо, что реакции протскают при прямом контакте фермента и веществ, претерпевающпх фермептатпвпое превращение— субстратов, и было выведено простейшее кинетическое выравзенпе для скорости такого превращения — уравнение Мнхазлпса — Мептэп.
Исследования ферментов показало, что катапнзнруомые пмп реакции чрезвычайно чувсзвнтольны к условиям протекания, такич, как температура, ионная сила и рй среды. Поэтому в 1 6.2 будет затронут и вопрос о влиянии РН и температуры. Кроме того, многие, не подвергающиеся химическому превращению вещества оказывают либо ускоряющее, либо замедляющее действие па фермептатпвный процесс. Поэтому а этой главе рассматрива>отея также вопросы об активацнн и пкгпбпрованни фермептативных процессов.
Важным событием в энзпмологнн — пауке о ферментах — было открытие каталитического действия рнбопукленновых кислот. Исследование РПК-фермептов— Рнбозимов — стало одной пз бурно развивающихся областей эпзнмологпи. Поэтому авторы сочли необходимым ввести 1 ОД. Наконец, чтобы дать читателю возможность заглянуть в будущее энзпмолопщ, авторы заклю тют эту главу ис большим разделом, посвященным дппалщческпл> аспектам молекулярной биологии, козт>рая в настоящее время находится в начальной фазе изучения. б.1. АКТИВНЫВ ЦЕНТРЫ ччлРМЕНТОВ Ферменты действуют на превращающийся субстрат или на взаимодействующие молекулы двух илн трех субстратов только при прямом контакте с ними, т.е.
необходимой стадией процесса, каталпзируемого ферментом (ферментативного превращения), является образование комплекса фермента с субстратом илн субстратами. При этом участники химического превращения непосредственно взаимодействуют с ограниченной частью белновой молекулы, называемой ахтиоильи цент- роль Селективность действия ферментов определяется высокоизбирательным узнаванием субстратов их активными центрами.
Часть активного центра, ответственную за селективное связывание, иногда называют одгорбциоиилл и центро.и фермента. Ту часть активного центра, которая принимает непосредственное участие в каталитическом процессе, называют хаплалитичеслтж центром. Эти два центра могут в известной мере перекрываться. Информацию о строении активных центров ферментов и распололкенлли в них субстратов получают в первую очередь путем рентгеноструктурного анализа самого фермента и его комплекса с каким-либо близким аналогом субстрата, который достаточно похож на субстрат, чтобы располагаться в активном центре сходным с ним образом, но не лложет подвергаться ферллептатлсвноллу превращенщо.
Такой комплекс может быть закристаллкзован и использован для получения необходимого набора данных по дпфракцни рензтеновскнх лучей. В отдельных случаях удается подобрать такие условия кристаллизации, в которых каталитического превращения субстрата не происходит, и это дает возможность исследовать методом рентгеноструктурного анализа комплекс фермент— субстрат. Сказанное люжно пояснить на примере ферллеллта, актпвщай центр и механизм действия которого достаточно хорошо изучены н который будет ниже детально рассматриваться, — панкреатической рибонуклеазы.
Этот фе1лллент катализируег двустадийный гидролпз фосфодизфнрпых связей в РПК, сходный в общих чертах со щелочнылс гидролилолс этих связей. На первой стадии происходит внутри- молекулярная атака атома Р на 2'О)1-группу примыкающего со стороны 3 '-кислородного атома остатка рнбозы с образоваппелл циклического 2',3 '-фосфата и разрывом межнуклеотпдной связи.
Во второй стадии происходит гидролпз пятпчленного фосфодиэфирного цикла. На примере одного из простейших субстратов рибонуклеазы — уридилпл(3 ' — лб ')аденозпна — процесс можно записать в виде н о ш'ц О Н СН О Або ан О. очень близок по структуре, но ферментом не гидролизуется и поэтому может образовать стабильный комплекс с рибонуклеазой. Рентгеноструктурный анализ этого комплекса позволил получить важные сведенил о строении активного цент- Р а фермента и вместе с другими данными сформулировать механизм каталитического действия фермента. Этот механизм хорошо объясняет все основные отличия' ферментативного гидролиза от протекающего по сходной схеме щелочного гидролнза.
Эти отличия сводятся к следующему: во-первых, процесс, ката- но о ого о оа ноч,о,. ада н но-, о,ц л + (ГЦ ой хо- он н он он о о н х / о о ~оо~ о Аналог этого субстрата, у которого вместо одного из атомов кислорода рибозо- фосфатного остова находится мегплеповая группа НО ОН Рис. 59. Схема активного центра рибонуклеазы н форме, благопри- ятстьующен протеканию нервов ставни реакции лизируемый ферментом, протекает с большой скоростью п1эи нейтральных слабощелочных значениях рН, при которых скорость щелочного гидролнза ненз меримо мела.
В нейтральной среде среднее время превращения цнтидин-2', 3' циклофосфата в составе комплекса с ферментом на трн порядка меньше, чем вр мя химического превращения о же субс рата в 1М щ очи. Во-в рых иуклеозид, примыкающий к атому Р со стороны 3 -кислородного атома, в случае ферментативного гидролиза должен быть пирииидиновым нуклеозидом, причем в случае аналогов уридина или цитидина они должны быть по структуре таковы чтобы резко предпочтительной была анти-конформация гликозидной связи; в- третьих, фермент катализирует только гидролиз фосфодиэфирных связей, обра зоваиных 3'- и 5'-гидроксилами соседних нуклеозидных фрагментов, в то время как щелочному гидролизу в равной степени подвержены и связи, образованные 2'- и 5'-гидроксигруппами; в-четвертых, при гидролизе циклического фосфата фермент дает исключительно 3'-концевой фосфат, в то время как прн щелочном гидролизе в близких количествах образуются 2 '- и 3 '-изомеры.
Все зти особенности получают свое объяснение при рассмотрении активного центра рибонуклеазы, схема которого приведена на рис, 59. Видно, что реакционная часть молекулы, включающая остаток фосфорной кислоты и 2 -гидрокснгруппу рибозы, располагается вблизи двух имидазольных колец остатков гистндина, Н)а-12 и И)а-119 (номера показывают положение соответствующих остатков в полипептидной цепи Фермента).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
