А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Он постоянно возникает на пути решения конкретных задач физики белка, идет ли речь о предсказании структуры белка по его аминокислотной последовательности (надознать, что предсказывать: самую стабильную или самую быстро сворачивающуюся его структуру), или о дизайне новых, не встречающихся в природебелков (надо знать, что делать: максимально усиливать стабильность желаемой структуры или пролагать максимально быстрый путь к ней).Обсуждение механизма сворачивания белков началось сразу же послерасшифровки первых трехмерных структур и открытия явления самоорганизации.
Первой, видимо, была гипотеза Филлипса, согласно которойна N-конце растущей цепи (с которого начинается биосинтез белка) воз-271никает зародыш структуры, и остальная цепь наматывается на него. В тойили иной форме такая точка зрения присутствует в ряде работ и по сей день.Однако она не подтвердилась. В изящных работах Гольденберга и крейтонабыло показано, что N-конец цепи не играет решающей роли в самоорганизации in vitro — по крайней мере для однодоменного белка.
Опыт показал,что замкнутая в кольцо цепь небольшого белка, ингибитора трипсина, сохраняет способность к самоорганизации; и даже если разрезать это кольцотак, что новым N-концом окажется бывшая середина цепи — самоорганизация ведет к прежней пространственной структуре. В наши дни изготовлениециркулярно пермутированных белков стало обыденным. В поисках пути к решению проблемы самоорганизации белков, О. Б. П.в 1973 г. предложил концепцию стадийного сворачивания белка (рис. 19-2).В рамках этой гипотезы, получившей позже название «framework model»(«каркасной модели»), и проходило, в значительной мере, дальнейшее обсуждение проблемы самоорганизации белка в мировой научной литературе.Рис. 19-2.
стадийная модель сворачивания белка по Птицыну (1973). Выделенывторичные структуры — α-спирали (цилиндры) и β-участки (стрелки). Оба предсказанные интермедиата впоследствии найдены на опыте и названы «предрасплавленной» и «расплавленной» глобуламиЭта модель постулировала последовательное вовлечение различныхвзаимодействий в формирование структуры белка и подчеркивала важность образования зародышевых α-спиралей и β-шпилек на ранних стадияхсворачивания, слипания этих зародышей в глобулу, грубо напоминающуюнативную, и окончательной «доводки» строения глобулы на последнемэтапе самоорганизации.краеугольным камнем этой концепции было то, тогда чисто гипотетическое, а теперь вошедшее в учебники состояние белковой цепи, котороеныне известно как «расплавленная глобула».272Выведенная буквально «на кончике пера» расплавленная белковая глобула была затем экспериментально обнаружена и детально исследованадолгих, семисотновым, Гильманшиным, Бычковой и др.
в лабораторииПтицына в 1980-х гг. — первоначально как равновесное состояние «слабоденатурированного» белка (об этом я говорил на прошлой лекции), а потом и как кинетический интермедиат сворачивания белка in vitro.так, расплавленная белковая глобула накапливается в процессе ренатурации карбоангидразы В (рис. 19-3). В ходе такого опыта исходное клубковое состояние денатурированного белка получается инкубированием егов растворе с высокой концентрацией денатуранта, а ренатурация получается быстрым разведением этого раствора большим количеством воды, т.
е.наблюдаемый процесс ренатурации стартует с клубка и заканчивается восстановлением нативного белка. Однако разные свойства ренатурирующегобелка меняются с разной скоростью, что свидетельствует о накоплении —в начале процесса ренатурации — какого-то «промежуточного» состояниябелковой молекулы.Рис. 19-3. кинетика восстановления «степени нативности» fN в процессе ренатурациикарбоангидразы В. Переход белка из полностью развернутого состояния (существовавшего при 5,45 М гуанидингидрохлорида)в нативное (при 0,97 М гуанидингидрохлорида) наблюдается по различным параметрам:приведенной вязкости (), эллиптичностипри 222 нм ( ) и 270 нм (—) и энзиматической активности (о о о).
картинка, с небольшими упрощениями, взята из D. A. Dolgikh,A. P. Kolomiets, I. A. Bolotina & O. B. Ptitsyn,FEBS Letters (1984) 164:88–92В данном случае видно, что «нативные» значения приведенной вязкости (характеризующей объем глобулы) и эллиптичности при 222 нм(характеризующей наличие вторичной структуры) восстанавливаются(точнее, почти восстанавливаются) в процессе ренатурации значительно быстрее, чем эллиптичность при 270 нм (характеризующая упаковку боковых групп в третичной структуре белка) или активность белка(являющаяся мерой нативности его третичной структуры). Это говорито существовании накапливающегося в значительных количествах (т.
е.метастабильного — «как бы стабильного»: ведь он существует в течениезаметного времени) кинетического интермедиата. Причем этот интермедиат является расплавленной глобулой: его компактность и вторичная273структура близки к таковым для нативного белка, однако он не имеетни нативной упаковки боковых групп (судя по эллиптичности в «ближнем» ультрафиолете, при 270 нм), ни энзиматической активности нативного («твердого») белка.расплавленная глобула оказывается — подчеркну, в примерно физиологических условиях — ранним промежуточным состоянием на стартующем из клубка пути самоорганизации многих глобулярных белков in vitro.для образования такого интермедиата достаточно миллисекунд, полное жевосстановление свойств нативного белка из 100–300 аминокислотныхостатков требует от секунд (для одних белков) до часов (для других).Необходимо подчеркнуть, что самый медленный (ratе-limiting) шагсамоорганизации приходится не на раннюю стадию, не на образованиерасплавленной глобулы, а на образование из нее плотно упакованной, нативной глобулы (см.
рис. 19-3). расплавленная глобула — не единственный интермедиат, наблюдаемыйпри сворачивании белка. состояние с частично сформированной вторичной структурой и с частичной компактизацией цепи (т. е. напоминающеепредрасплавленную глобулу) было обнаружено, когда стало возможнымисследовать явления, происходящие в течение первых миллисекунд сворачивания, т. е. еще до образования расплавленной глобулы. В белках с дисульфидными связями были зафиксированы различные интермедиаты, позволяющие проследить последовательность формирования S-S-связей, и т.
д.Надо сказать, что гипотеза о «кинетическом контроле» сворачивания белкачрезвычайно способствовала изучению интермедиатов сворачивания. Главнаяидея этого направления работ заключалась в том, что, выделив интермедиаты,мы сможем проследить путь сворачивания белка. В химии и биохимии этообычно позволяет понять, как протекает сложная реакция. таким образом, исследования шли в русле, как теперь говорят, «химической логики», императивкоторой — «ищи и выделяй промежуточные состояния!».Но при изучении самоорганизации белков эта логика сработала только частично: интермедиаты (расплавленные глобулы) были определены для оченьмногих белков, но ключевой вопрос — как может белковая цепь найти своюнативную структуру за очень малое время? — остался без ответа. Прогресс в понимании был достигнут при изучении маленьких (из 50–100 остатков) белков.
Оказалось, что некоторые из них сворачиваются invitro без наблюдаемых, без «накапливающихся» в эксперименте интермедиатов. Причем это отсутствие наблюдаемых интермедиатов относитсяне только к специально созданным условиям, близким к точке плавления белка (где одностадийной кинетики сворачивания можно ожидатьa priori, исходя из того, что термодинамика де- и ренатурации соответ-274ствует, как известно, переходу типа «все-или-ничего», т. е.
отсутствиюсколько-нибудь заметного количества «полусвернутых» форм белка); оноотносится — для этих небольших белков — также и к «физиологическим»условиям, при которых сворачивание большинства белков проходит черезинтермедиаты типа расплавленной глобулы.При изучении малых белков, не имеющих ни S-S-связей, ни cis-пролинов(т.
е. именно тех особенностей, которые ранее широко эксплуатировалась,чтобы поймать интермедиаты сворачивания) оказалось, что такие, лишенные «ненужных усложнений» (S-S-связей и cis-пролинов) белки порой сворачиваются очень быстро, особенно в чистой воде (или в физиологическомрастворе) — не только много быстрее больших белков (что не удивительно), но и не медленнее тех малых, наличие интермедиатов в сворачиваниикоторых должно было, казалось бы, ускорить и облегчить их правильноесворачивание…Обычно белки «однодоменного» размера сворачиваются в физиологическом растворе (с наблюдаемыми, накапливающимися интермедиатами)за секунды или десятки секунд, но некоторые из малых белков, сворачиваясь без накапливающихся интермедиатов, достигали нативной структурыза миллисекунды (рис. 19-4) или даже за доли миллисекунд (правда, этобыли самые маленькие белки — до 100 остатков длиной).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
