А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 56

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 56)

Однако, растворяя тела включения, из них можно добыть нативный белок — путем ренатурации in vitro.с неприятностями, причиняемыми агрегацией (столь естественнойв концентрированном «клеточном супе»), в клетке борются шапероны.«Малые» шапероны типа hsp70 (heat shock protein, 70 килодальтон) связываются с белком, предохраняя его от агрегации, а потом сбрасываются (на что расходуется АтФ). «Большие» шапероны типа GroEL / GroESили TriC работают, в основном, с многодоменными белками и, особенно — с белками, чьи домены составлены из отдаленных кусков цепи.Эти шапероны образуют как бы пробирку, сделанную из белка GroEL(диаметром в несколько нанометров — и с крышечкой, сделанной из белкаGroES, то прилипающей к GroEL, то отлипающей от него).

Внутрь этойпробирки (или, скорее, на самый вход в нее, как показано работами группыГ.В. семисотнова) и садится – in vitro – развернутая (или находящаясяв состоянии расплавленной глобулы) белковая цепь. In vivo так же, повидимому, поступает новосинтезированный (и до встречи с GroEL облепленный шаперонами типа hsp70 и/ или hsp40) белок или его домен. согласно распространенной в настоящее время точке зрения, эта «пробирка»(иногда ее называют «ячейкой Анфинсена») защищает новорожденныйбелок и от агрегации, и от действия концентрированного клеточного«супа» со всеми его протеазами и т.

д. При этом, как полагают, эта пробирка время от времени активно «трясется» (при этом в GroEL происходят конформационные превращения, увеличивающие и уменьшающиеего гидрофобную поверхность), т. е. она открывается (на что расходуетсяАтФ) и закрывается, но отпускает она белок только тогда, когда он ужесвернется и перестанет липнуть к «пробирке». Впрочем, работами группы Г.В.

семисотнова показано, что, скорее, GroEL просто убирает израствора «избыточные» неструктурированные белки, что позволяет немногочисленным, оставшимся в растворе белкам избежать агрегации иправильно свернуться без всякого прямого взаимодействия с шаперономGroEL. таким образом, шапероны, так или иначе, служат «инкубаторами»для сворачивающегося белка; однако, как было недавно показано в группеА.с. спирина, они работают и как «холодильники», задерживая сворачивание белка до тех пор, пока он не сможет включится в нужную четвертичную структуру или не будет перенесен в нужное место клетки.268кроме того, самоорганизация белков может ускоряться некоторымиферментами типа пролил-изомеразы (катализирующей медленно самопо себе идущее превращение trans-пролинов в cis- и обратно; иногдаименно оно лимитирует скорость сворачивания) или дисульфид-изомеразы(катализирующей сшивание и расшивание S–S-связей). В живой клетке сворачивание белка происходит в насыщенном макромолекулярном окружении.При этом, согласно хорошо обоснованной гипотезе к.

добсона, ключевымэлементом процесса обычно является расплавленная глобула: именно ее образует белковая цепь при биосинтезе, именно ее оберегают от агрегации шапероны (а если не уберегут – именно из нее образуются амилоиды и другиеагрегаты, часто болезнетворные), и именно из нее образуется нативный белок.За время эволюции возник ряд механизмов, позволяющих уйти от проблем, создаваемых насыщенным окружением белка в клетке. Эти механизмывключают как действие разных семейств молекулярных шаперонов, так и котрансляционное сворачивание, важность которого все возрастает по сравнению с посттрансляционным, особенно в эукариотических клетках с ихпреимущественно многодоменными белками. Однако при этом, по-видимому,не существует оснований предполагать, что что-либо, кроме самой аминокислотной последовательности, обеспечивает верную конформацию белка (вовсяком случае, одно- или двухдоменного) в клеточном окружении — хотя некоторые исследователи все еще предполагают противоположное.Одной из замечательных идей, следующей из работ недавнего времени, является гипотеза «эволюционного сдвига» от посттрансляционногок котрансляционному сворачиванию по мере того, как эукариотическиеклетки возникали из комбинаций прокариотических, и по мере того,как развивались более крупные и сложные белки (типичный белок эукариот состоит из четырех-пяти доменов, прокариот — из двух).котрансляционное сворачивание, т.

е. сворачивание растущей белковойцепи за время, пока она еще прикреплена к рибосоме, вызывает особеннобольшой интерес из-за последних замечательных достижений в исследовании структуры рибосомы в атомном разрешении. сворачивание растущегопептида может облегчаться «туннелем» рибосомы, где этот пептид, возможно, первоначально находится — защищенный от агрегации и деградации.Более того, существуют некоторые (правда, не вполне еще достаточные)данные, что сама рибосома и некоторые из компонент рибосомы, в особенности ее большая субъединица и, в частности, ее 23S рНк, могут функционировать как молекулярные шапероны, способные облегчить и ускоритьсворачивание предварительно денатурированных белков.

такое действиерибосом дало бы дополнительное (наряду с простой затрудненностью агрегации для сидящих на рибосоме белков) объяснение тому факту, что сво-269рачивание больших денатурированных белков in vitro (без рибосом) частопроисходит гораздо медленнее, чем сворачивание белков in vivo, котороепроисходит одновременно с их биосинтезом на рибосоме.Однако опыты по сворачиванию белка in vitro показывают, что работавсей этой клеточной машинерии может быть заменена подбором соответствующих внешних условий (малой концентрации белка, нужногоокислительно-восстановительного потенциала). Эта замена не меняетрезультат сворачивания: уж если белок не выпал в осадок, а свернулся invitro, то он свернулся в ту же структуру, что и in vivo.

Правда, часто этозаймет больше (а иногда и меньше!) времени, чем самоорганизация invivo, но результат будет тот же.Более того: известно, что небольшую белковую цепь можно чисто химически синтезировать in vitro (в пробирке) — и притом с с-,а не с N-конца — и она, с хорошим выходом, свернется в правильную пространственную структуру.Все это доказывает, что вся необходимая для построения трехмернойструктуры белка информация содержится в химической последовательности аминокислот в его цепи.Похоже, что — помимо самого синтеза белковой цепи — биосинтетический аппарат клетки (рибосома + шапероны +…) служит лишь чем-то вродеинкубатора для сворачивания пространственной структуры белка: этот «инкубатор» не определяет структуру белка, но он создает условия для ее созревания, так же, как обычный инкубатор обеспечивает выведение птенца,не предопределяя, кто выведется — цыпленок или утенок.Внутренний голос: Все это, строго говоря, относится в основном к небольшим водорастворимым глобулярным белкам (и доменам больших белков).

сложнее с крупными белками, особенно — с белками высших организмов: далеко не все они ренатурируют спонтанно. Что касается спонтаннойсамоорганизации мембранных и фибриллярных белков, в некоторых белкахона происходит, но обычно полностью ренатурировать их не удается…Лектор: Насчет «трудных» для ренатурации белков: возможно, здесьдело в агрегации (так, некоторые мембранные белки ренатурируют в детергентах, хотя в воде они не ренатурируют); возможно — в посттрансляционной модификации, особенно у эукариот. договоримся, что покая буду иметь в виду относительно небольшие глобулярные белки.

Поймемсначала самоорганизацию хотя бы их… Загадочность явления спонтанной самоорганизации белков (и рНк) суммируется «парадоксом Левинталя». Загадка состоит вот в чем. У белковойцепи есть бездна возможных конформаций (каждый аминокислотный остаток270имеет около 10 возможных конформаций, то есть цепь из 100 остатков — порядка 10100 возможных конформаций). так что белок должен искать «свою»пространственную структуру среди порядка 10100 возможных. При этомбелок может «почувствовать» стабильность конформации, только попавпрямо в нее, так как отклонение даже на 1 Å может очень сильно повысить энергию цепи в плотной белковой глобуле.

И так как переход из однойконформации в другую занимает ~10–13 секунды как минимум, перебор всех10100 структур должен был бы занять порядка 1080 лет, на фоне которых время жизни нашей Вселенной — 1010 лет — величина бесконечно малая… Вопрос: как белок может «найти» свою структуру за минуты?Парадокс же заключается в следующем. с одной стороны, нативнаяпространственная структура по всем тестам ведет себя как самая стабильная из всех структур цепи: белковая цепь попадает в нее при разныхкинетических процессах [и при сворачивании на рибосоме в процессебиосинтеза, и после транслокации сквозь мембрану, и при сворачиваниив пробирке (ренатурации) — чем бы и как бы она ни была в этой пробиркеразвернута (или просто синтезирована химически)].

с другой стороны,не может быть никаких гарантий, что эта структура — самая стабильнаяиз всех возможных: как показывает прикидка Левинталя, у белковой цепипросто нет времени на то, чтобы убедиться в этом!«как же белок выбирает свою нативную структуру среди бесчисленного множества возможных? — спросил Левинталь, и ответил: —По-видимому, самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному “пути сворачивания”, и та структура, где этот путь заканчивается,и является его нативной структурой».

Иными словами, Левинталь предположил, что нативная структура белка определяется не стабильностью,не термодинамикой, а кинетикой, т. е. она соответствует не глобальному,а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи.Вопрос о том, что именно — кинетика или термодинамика — определяетукладку белковой цепи, отнюдь не чисто умозрительный.

Характеристики

Список файлов лекций