А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 53
Текст из файла (страница 53)
качественная зависимость плотности ρ обычного полимера от энергиивзаимодействия мономеров ε, выраженной в единицах kT. скачка плотности здесьне наблюдается, т. е. это превращение не является переходом типа «все-или-ничего».Однако, начиная с какой-то величины –ε/kT, скорость роста ρ с –ε/kT резко меняется (см. излом кривой, слева), что характерно для фазовых переходов второго рода.В дальнейшем этот рост постепенно затухает, уже без всякого фазового переходатак говорит простейшая теория расплавленной глобулы. Фактически, онаговорит, что расплавленная глобула не является точно очерченным состояниемсо стороны клубка — она не отделена от него переходом «все-или-ничего».Но это — результат простейшей теории, не принимающей во внимание неоднородность белка.
Может быть, нужна более изощренная теория?255 Посмотрим, что говорит эксперимент. Он, прежде всего, говорит,что разворачивание расплавленной глобулы выглядит как кооперативный(«S-образный») переход (рис. 18-5). Однако — эта «S-образность» совместима и с рис. 18-4 (разворачиванием, когда плотность меняется быстро,но без скачка), и с переходом типа «все-или-ничего».Рис. 18-5. Относительное изменение спектров кд α-лактальбумина в ближнем(270 нм) и в дальнем (224 нм) ультрафиолете с изменением концентрации денатуранта(гуанидингидрохлорида).
fd = 0 отвечает сигналу от нативной структуры, fd = 1 —от полностью денатурированной молекулы. «Промежуточное состояние» существуетмежду первым и вторым переходом и является (как показало его дальнейшее исследование) «расплавленной глобулой». картинка, с небольшими изменениями, взятаиз W. Pfeil, V. E.
Bychkova & O. B. Ptitsyn, FEBS Letters (1986) 198:287–291Итак: является ли разворачивание расплавленной глобулы переходомтипа «все-или-ничего» на опыте?Здесь пока нет полной ясности. термодинамические исследования многих белков показывают, что, по всей видимости, — нет, не является. ОднакоУверским и Птицыным было показано, что состояние расплавленной глобулы может быть, по крайней мере в некоторых белках (например, в карбоксиангидразе), отделено от «менее плотного» состояния переходом типа«все-или-ничего» (рис.
18-6). Правда, карбоксиангидраза — β-структурныйбелок, так что наблюдаемый переход может относиться к распаду ееβ-структуры (в синтетических полимерах он протекает как переход типа«все-или-ничего»). к тому же наблюдающийся в ней переход столь медленен, что засекается хроматографией, а образование расплавленной глобулыв кинетических опытах (о которых будет говориться в следующей лекции) — процесс очень быстрый… Неясности остаются…В момент перехода это «менее плотное» состояние лишь немногимменее компактно, чем расплавленная глобула, и содержит примерно вдвоеменьше вторичной структуры, но оно намного более компактно и структурировано, чем клубок. Поэтому это состояние называют «пред-расплавленнойглобулой».
Надо отметить, что близость свойств «пред-расплавленной»и «расплавленной» глобул порой ведет к большим недоразумениям…256Рис. 18-6. сосуществование двух фаз, «компактных расплавленных глобул» (с) и «менее плотных глобул» (LC)при хроматографировании белка в области таких концентраций денатуранта (гуанидингидрохлорида), гдерасплавленная глобула начинает разваливаться. Обратитевнимание на раздвоенность пика на хроматограммах, сделанных при 0,55–0,63 М GDmCl. картинка, с небольшимиупрощениями, взята из V.
N. Uversky, G. V. Semisotnov,R. H. Pain & O. B. Ptitsyn, FEBS Letters (1992) 314:89–92дальнейшее разворачивание «пред-расплавленной» глобулы до клубкаявляется плавным, как того требует показанная на рис. 18-4 теория переходов «глобула — клубок» в «обычных» полимерах, обсуждавшаяся на прошлой лекции.сосуществование двух фаз — «расплавленных» и «менее плотных» глобул — наблюдается при хроматографировании белка в области таких концентраций денатуранта, где расплавленная глобула разваливается.
Наличиераздвоенного пика на таких хроматограммах (рис. 18-6) доказывает, что данный белок существует либо в одной форме (расплавленной — это установлено другими измерениями), либо в другой (какой-то «менее плотной»),но не в форме глобулы какой-то промежуточной между ними плотности.О наличии переходов типа «все-или-ничего» свидетельствует, в принципе, достаточная узость зоны температурного плавления белка (вспомнитекритерий Вант-Гоффа). Но критерий Вант-Гоффа не приложишь к плавлению расплавленных белков: как показывает опыт, они, как правило,дальше не плавятся! Однако плавление расплавленных глобул было обнаружено при калориметрическом исследовании ряда искусственно созданных белков, которые, как оказалось, даже при физиологических условияхимеют форму расплавленной глобулы.
к тому же дополнительное исследование ширин переходов «расплавленная глобула — клубок» при денатурации природных белков сильными денатурантами показало, что этиширины для многих однодоменных белков обратно пропорциональныразмеру белка, что более всего совместимо с тем, что кооперативной единицей разворачивания является целый такой белок, — то есть с переходомтипа «все-или-ничего».257 Похоже, что переход расплавленной глобулы в клубок начинается, покрайней мере в некоторых белках, с ее фазового перехода в «пред-расплавленную» глобулу, а затем последняя разворачивается до клубка уже постепенно. Но выяснение природы этих переходов требует дальнейших экспериментальных и теоретических исследований.(или белки «ослабленные», как, например, апомиоглобин, т.
е. миоглобин,ослабленный лишением гема) демонстрируют холодовую денатурацию —денатурацию, при которой всегда образуется клубок. У более стабильных белков она не наблюдается, точнее, она, видимо, просто приходитсяна температуры, когда вода замерзает и тем прекращает наши опыты…Итак, возвращаясь к фазовой диаграмме танфорда (рис. 18-7), мывидим, что нативное состояние отделено от всех других (и от клубкаCOIL, от температурно-денатурированного состояния MOLTEN) переходом типа «все-или-ничего» (что и обуславливает сравнительную узостьэтих переходов); что денатурированное состояние обязательно отличается от нативного подвижными боковыми группами, но может бытьвесьма компактным; и, наконец, что переход из температурно-денатурированного состояния в клубок может быть как фазовым переходом типа«все-или-ничего» для одних белков, так и (возможно) не-фазовым переходом — для других. сейчас мы продолжим рассмотрение термодинамики белковых молекул под несколько иным углом зрения, а именно: какие свойства молекулыбелка нужны для того, чтобы она разрушалась не постепенно, а переходомтипа «все-или-ничего»? то есть, чтобы она, не размягчаясь, долго терпелавнешнее воздействие, а потом сразу ломалась бы? (Ясно, что такое поведение способствует надежности работы белка: уж если он работает — то работает, как надо; а не работает — значит, совсем сломался…)Рис.
18-7. Фазовая диаграмма конформационныхсостояний лизоцима при рН 1,7 в растворе гуанидингидрохлорида при различных температурах.NATIVE — нативное состояние, COIL — клубок,MOLTEN — температурно-денатурированное состояние. жирная линия показывает середину перехода,пунктир — зону перехода (предположительно, от соотношения 9:1 в пользу одного состояния до 1:9 в пользудругого; видно, что переход COIL — MOLTEN значительно шире, «менее кооперативен», чем переходыNATIVE — COIL и NATIVE — MOLTEN). картинка,с небольшими изменениями, взята из C. Tanford, Adv.Prot. Chem.
(1968) 23:121–282Маленькое отступление. Вообще, нас не должно удивлять, что разныебелки ведут себя по-разному. И здесь дело не столько в качественных различиях между белками, сколько в том, что мы наблюдаем каждый белок через «экспериментальное окошко», где температурный диапазон ограниченсуществованием жидкой воды, а диапазон воздействия денатуранта — егонулевой концентрацией.
Поэтому, например, менее гидрофобные по своему аминокислотному составу белки — белки, чья глобула легко разрушается денатурантом, — будут демонстрировать в этом «окошке» толькопереход в клубок (ведь расплавленная глобула держится только остаточными гидрофобными взаимодействиями). И эти же малостабильные белки258 Имея графики зависимости и энтропии S, и энергии Е от плотностиглобулы ρ (см. рис. 18-3), мы можем построить график зависимости Sот E и, далее, нарисовать характерный вид энергетического спектра белка(рис. 18-8а).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
