А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 49
Текст из файла (страница 49)
17-5. Изменение удельной (на грамм белка) разности энергий нативного и денатурированного состояний белка с температурой (а) и изменение свободных энергийв расчете на моль белковых молекул (б). картинки, с небольшими изменениями, взяты из P. L. Privalov & N. N. Khechinashvili, J. Mol. Biol. (1974) 86:665–684Парадоксально, но при холодовой денатурации дело обстоит в точности так, как при кипении воды. как известно, кипения можно добитьсядвумя путями: либо подняв температуру, либо понизив внешнее давление. Гидрофобное давление, сжимающее белковую цепь, сильно падаетпри уменьшении температуры — и белок может «закипеть».кстати — действительно «закипеть» (в смысле — резко понизить своюплотность): если при повышении температуры белок как бы «плавится»,т.
е. его объем обычно растет не слишком сильно, то при холодовой денатурации белковая цепь всегда совершенно разворачивается и занимаемыйею объем растет многократно. Это естественно подводит нас к вопросу о том, как выглядит денатурированный белок.Бурные дискуссии на эту тему велись еще в 1950-х гг., продолжалисьв 60-х, 70-х, 80-х и только потом привели к некоторому консенсусу.Проблема была в том, что разные опыты приводили к разным выводам.так, многочисленные термодинамические опыты показывали, что в области денатурированного состояния белковой молекулы в ней нет никакихкооперативных структурных превращений.
Поэтому первоначально полагали, что денатурированный белок всегда является очень рыхлым клубком(каковым он, действительно, является в хороших растворителях типа концентрированных растворов мочевины).Однако столь же многочисленные структурные исследования денатурированных белков упорно свидетельствовали о каких-то крупных перестройках в рамках денатурированного состояния, о каких-то «промежуточных» структурных состояниях между полностью развернутой (клубковой)и нативной формами молекулы (рис. 17-6).237Рис. 17-6.
Фазовая диаграмма конформационных состояний лизоцима при рН 1,7в растворе гуанидингидрохлорида при различных температурах. NATIVE — нативноесостояние, COIL — клубок, MOLTEN —температурно-денатурированное состояние.сплошная линия показывает середину перехода,штриховая — зону перехода (предположительно, от соотношения 9:1 в пользу одного состояния до 1:9 в пользу другого; видно, что переходCOIL — MOLTEN значительно шире, «менеекооперативен», чем переходы NATIVE —COIL и NATIVE — MOLTEN).
картинка, с небольшими изменениями, взята из C. Tanford, Adv.Prot. Chem. (1968) 23:121–282Вообще, экспериментальные данные о состоянии белковой молекулыпосле денатурации были очень противоречивы. В одних случаях белкиказались полностью «развернутыми» и бесстуктурными, в других — довольно структурированными и/ или компактными, а для их полного разворачивания нужны были сильные растворители («денатуранты»).разобраться в этой противоречивой картине удалось только, исследуяструктуры денатурированных белков целым букетом методов. В этот букетвходили и измерения вязкости (дающие объем молекул белка), и спектрыкд в дальнем ультрафиолете (отражающие вторичную структуру белка),и спектры кд в ближнем ультрафиолете (отражающие асимметрию, т.
е.упорядоченность окружения ароматических боковых групп), а также и инфракрасная спектроскопия, и ЯМр, и исследование активности белков,и многое другое. Весь этот арсенал и был применен к исследованию денатурации белков группой О. Б. П., к которой А. В. Ф.
принадлежал в качестве теоретика. Оказалось, что, кроме активности белка, есть только две вещи, которые всегда резко меняются при денатурации. Это — (1) упорядоченностьокружения боковых групп белка, наблюдаемая как по кд в ближнем ультрафиолете (рис. 17-7а), так и при помощи ЯМр, и (2) фиксированностьглобулярной структуры, наблюдаемая — посредством ЯМр — по скоростиобмена водорода Н полярных групп белка на дейтерий D окружающейводы, а также по ускорению протеолиза белковой цепи.степень же упорядоченности главной цепи белка (ее вторичная структура), размеры глобулы и даже плотность ее гидрофобного ядра могуткак практически сохраняться, так и меняться очень сильно (рис. 17-7б).238aбРис. 17-7.
спектры кд в ближнем (а) и дальнем (б) ультрафиолете для нативногоα-лактальбумина () и для него же, денатурированного теплом (), кислотой( ) и сильным денатурантом (). спектры кд в ближнем УФ всегда сильноменяются при денатурации. спектры кд в дальнем УФ существенно меняютсятолько при сильном разворачивании белка денатурантом (см. кривую). картинки, с разрешения, взяты из статьи: D. A. Dolgikh, L. V.
Abaturov, I. A. Bolotina,E. V. Brazhnikov, V. E. Bychkova, V. N. Bushuev, R. I. Gilmanshin, Yu. O. Lebedev,G. V. Semisotnov, E. I. Tiktopulo & O. B. Ptitsyn. Compact state of a protein moleculewith pronouncedsmall-scale mobility: bovine alpha-lactalbumin. (Figs.
3a, 4). Eur. Biophys. J. (1985) 13:109–121, © Springer-VerlagВ ходе этих исследований был обнаружен весьма универсальныйинтермедиат разворачивания (и сворачивания) белков, позже названный«расплавленной глобулой» (рис. 17-8, 17-9). Важнейшие свойства этого интермедиата суммируются табл. 17-1.Рис. 17-8.
Относительное изменение спектров кд α-лактальбуминав б л и ж н е м (270 нм) и в дальнем(224 нм) ультрафиолете с изменениемконцентрации денатуранта (гуанидингидрохлорида). fd = 0 отвечает сигналуот нативной структуры, fd = 1 — от полностью денатурированной молекулы.«Промежуточное состояние» существует между первым и вторым переходом. В области, отвечающей примерно двум молям гуанидингидрохлорида, всемолекулы белка существуют (как показало их дальнейшее исследование) в виде«расплавленных глобул».
картинка, с небольшими изменениями, взята из W. Pfeil,V. E. Bychkova & O. B. Ptitsyn, FEBS Letters (1986) 198:287–291239Рис. 17-9. схематическая модель нативной и расплавленной глобулы в молекулебелка. для простоты, на рисунке показаны только две α-спирали, соединенныепетлей. каждая вторичная структура покрыта множеством боковых групп; прошитая водородными связями, вторичная структура стабильна, пока проникающийвнутрь растворитель не «растворит» глобулу. Вода обычно не способна это сделатьбез добавления денатуранта. Входящие в гидрофобное ядро белка боковые группызаштрихованы.
В расплавленной глобуле они обретают свободу движений, выигрывают энтропию, но теряют энергию плотного контакта. так в расплавленной глобуле возникают поры, куда вода (•) проникает, не разваливая расплавленную глобулутаблица 17-1. Основные свойства расплавленной глобулыи методы их регистрациисвойства расплавленной глобулы на первый взгляд противоречивы. В ней существует развитая вторичная структура и притом обычнопрактически в том же количестве, что и в нативном белке.
Зато в ней(как и в полностью развернутом белке) почти отсутствует упорядоченность боковых групп, столь характерная для нативного белка. В то же время в ней явно остается какая-то доля нативных контактов боковых групп,особенно ароматических (но не алифатических), это показывает ЯМр. Онанемного менее компактна, чем нативный белок (как показывает измерениеее гидродинамического объема), а в своем ядре даже почти так же компактна (как показывает «среднеугловое» рассеяние рентгеновских лучей) —но довольно высокая скорость водородного обмена в расплавленной глобуле показывает, что по крайней мере отдельные молекулы растворителялегко проникают вглубь нее.
до известного предела эти противоречияудается примирить предположением о неоднородности расплавленнойглобулы, о наличии в ней более плотного, более нативоподобного ядраи более распушенных петель — но все же предположение о полностью нативном ядре и полностью развернутых петлях явно не согласуется с опытом, хотя бы с отсутствием в расплавленной глобуле упорядоченностиокружения даже ароматических боковых групп. Последнее наблюдаетсякак по кд в ближнем ультрафиолете, так и по спектрам ЯМр.для очень многих (хотя и не для всех) белков «расплавленная глобула»появляется при умеренном денатурирующем воздействии на нативныйбелок и исчезает (превращается в неупорядоченный клубок) лишь с добавлением концентрированного денатуранта.
состояние, похожее на расплавленную глобулу, часто получается и при повышении температуры.При этом переход нативного белка в расплавленную глобулу всегда, когдаэтот вопрос выяснялся, оказывался переходом «все-или-ничего». «расплавленная глобула» обычно не плавится кооперативно при дальнейшемнагреве, но ее разворачивание в клубок сильным денатурантом выглядиткак кооперативный S-образный переход.Некоторые нативные белки (особенно небольшие), однако, разворачиваются прямо в клубок, минуя стадию расплавленной глобулы. А некоторые другие белки одними агентами денатурации (например, температуройили кислотой) превращаются в расплавленную глобулу, а другими (например, мочевиной) — в клубок. Противоречивость результатов структурных и термодинамических исследований денатурации белков, а также физическая природа нового фазового состояния белков, состояния «расплавленной глобулы», требовалитеоретического осмысления.240241для понимания природы состояния расплавленной глобулы важно,что она получается из нативного состояния путем кооперативного температурного плавления — фазового перехода первого рода.
Это означает, что онообладает значительно большей энтальпией и энтропией, чем нативное состояние, т. е. что внутримолекулярные взаимодействия в нем резко ослаблены, а подвижность белковой цепи резко увеличена. так как большинствовнутренних степеней свободы в белке связано с мелкомасштабными флуктуациями структуры, и прежде всего с движениями боковых групп, именнораскрепощение таких флуктуаций может сделать состояние расплавленнойглобулы термодинамически выгодным.
Однако раскрепощение мелкомасштабных флуктуаций не требует полного разворачивания белковой цепи —достаточно лишь ее небольшого набухания. При этом, однако, в белке резкоослабляется Ван-дер-Ваальсово притяжение: оно сильно зависит от расстояния и даже небольшого увеличения размеров молекулы достаточно для егозначительного ослабления (см. рис. 17-9).В общем, здесь все похоже на плавление кристалла: небольшой ростего объема рвет часть Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий в нем и раскрепощает движения молекул.
Неясно было только, почему столь гетерогенная система, как белок, разрушается фазовым переходом, как кристалл,составленный из одинаковых молекул (или молекул немногих сортов):ведь в белке нет выраженной периодической кристаллической решетки,разрушение которой и плавит кристалл.Изучение «расплавленной глобулы» послужило и ключом к пониманию кооперативности денатурации белка — процесса, не похожего на то,что происходит ни с синтетическими полимерами, ни с дНк или рНк.Что до последних двух — понятно: у них нет единого перехода типа«все-или-ничего».
то же касается заодно и переходов спираль-клубок в полипептидах.А вот, скажем, уже изученное нами образование β-структуры? Ведьтам переход типа «все-или-ничего» существует? да, существует. Однакопри этом «не-β-структурная» цепь — типичный клубок: она совсем рыхлая, и в ней нет вторичной структуры.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
