А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Во-вторых, в переходе «всеили-ничего», как и в фазовых переходах первого рода, короткоживущиепромежуточные состояния наблюдать можно, в основном косвенно, – поих влиянию на кинетику перехода через свободно-энергетический барьер,разделяющий два непосредственно наблюдаемых состояния. Об этомречь пойдет на следующей лекции. В-третьих, было обнаружено, что внекоторых маленьких белках этот свободно-энергетический барьер такмал, что наблюдаемый в них переход сильно напоминает, по заключениюВ. Муноца, фазовый переход второго рода. Но это – наблюдаемое в оченьмаленьких белках исключение из общего (присущего белкам среднегоразмера и большинству маленьких белков) правила. Чтобы понять денатурацию белка, надо объяснить, почему существуют два равно стабильных фазовых состояния белковой цепи (как мы ужезнаем, в обычных полимерах это невозможно) и почему они разделенысвободно-энергетическим барьером (который, как мы знаем, и создаетпереход типа «все-или-ничего»).
то есть надо понять, почему белковаяглобула не может разрушиться путем постепенного набухания, как то делают обычные полимерные глобулы.При таком объяснении надо учесть основные (по сравнению с «простополимером») особенности белка: то, что он имеет одну укладку цепи, отличающуюся особой стабильностью; то, что в белковой цепи подвижныебоковые группы сидят на жесткой главной цепи; и то, что нативный белокупакован плотно, как кристалл (хотя и без кристаллической решетки):в белках, как и в молекулярных кристаллах, Ван-дер-Ваальсовы объемыатомов занимают 70–80 % всего объема, а в жидкостях (в расплавах) —только 60–65 %.251Итак.
Боковые группы белковой цепи способны к поворотной изомеризации, т. е. к резким прыжкам из одной разрешенной конформациив другую. Но для такого прыжка необходим определенный свободный объем вблизи «прыгающей» боковой группы. Боковые же группы, слагающиегидрофобное ядро белка, сидят на жесткой (в особенности из-за наличияα-спиралей и β-листов, необходимых, как мы видели, для создания ядра)главной цепи (рис.
18-1). Эти структуры стабильны, пока в глобулу не попал растворитель (для чего нужен тот же свободный объем). И жесткие этисегменты перемещаются как целое (по крайней мере в начале расширенияглобулы), со всем своим лесом боковых групп. Поэтому расширение глобулы, т. е. расхождение этих сегментов (вспомним, что нативная укладкабелковой цепи отличается плотной упаковкой вторичных структур в глобулу, и поэтому особой стабильностью), создает примерно одинаковыйсвободный объем вблизи каждой боковой группы, и он либо недостаточендля изомеризации каждой из них (пока глобула расширилась мало), либодостаточен для поворотной изомеризации многих.
так что освобождениебоковых групп (и проникновение растворителя) наступает лишь тогда,когда расширение глобулы превосходит некий порог, «барьер» (рис. 18-2).Эти два события могут сделать менее плотное состояние белковой цепистоль же стабильным, как ее нативное состояние, но не ранее, чем барьерная плотность останется позади.Рис. 18-1. схема упаковки боковыхгрупп.
Показан лишь маленький фрагмент ядра. Заштрихованная область Wсоответствует альтернативному ротамерубоковой группы (χ — угол ее вращения);этот ротамер запрещен плотной упаковкой. для его появления нужен дополнительный объем W ≈ 30 Å3 (т. е. ≈ 1 / 5 объема среднего аминокислотного остатка)Рис. 18-2. Причина существования свободно-энергетического барьера междунативным и любым денатурированнымсостоянием белка. «Барьерное» состояние возникает при небольшом расширении нативного. В этом состоянии порыв белке уже приводят к значительномуповышению Ван-дер-Ваальсовой энергии, но еще не позволяют ни поворотнойизомеризации, ни проникновения воды(•) внутрь белка252Поэтому малое («до-барьерное») расширение нативной глобулы всегданевыгодно — оно повышает ее энергию (так как части глобулы уже расходятся), но не повышает ее энтропию, так как еще не открывает поворотнойизомеризации ее боковых групп.
то есть свободная энергия глобулы растетпри малом расширении. Наоборот, большое («за-барьерное») расширениеглобулы открывает поворотную изомеризацию и ведет (при достаточно высокой температуре) к падению ее, глобулы, свободной энергии. В результатеденатурация белка при изменении внешних условий происходит не постепенно, а скачком (скачком через барьер), по принципу «все-или-ничего».то есть белок, не меняясь, терпит изменение внешних условий до некоторого предела, а потом плавится, как микроскопическое твердое тело,весь сразу.
такая устойчивость и твердость белка, в свою очередь, обеспечивает надежность его работы в организме.Иными словами, фазовый переход между нативным и денатурированным состояниями объясняется скачкообразным ростом энтропии (и преждевсего — энтропии боковых групп) при расширении глобулы (рис. 18-3),Рис. 18-3. Причина наличия перехода«все-или-ничего» при денатурации белка.Энергия Е минимальна при плотной упаковке глобулы (здесь ее плотность ρ = 1)и монотонно растет при сжатии или расширении. Энтропия S растет с падениемплотности ρ сперва медленно (при ρ == 1,0–0,8, пока боковые группы лишь колеблются, а их поворотная изомеризацияеще невозможна), затем быстро (когдаповоротная изомеризация начинает раскрепощаться), и затем (когда поворотнаяизомеризация уже свободна) — опятьмедленно.
Неравномерный рост энтропиисвязан со следующим эффектом. для поворотной изомеризации вблизи боковой группы должен быть свободный объем размером по крайней мере с сН3-группу. А так как боковая группа привязана к жесткойглавной цепи, такой объем не может появиться у одной лишь группы, он одновременно появится у многих. Поэтому и существует характерная («барьерная») плотностьглобулы, где энтропия начинает резко расти с расширением глобулы. Эта плотностьдовольно высока: ≈ 80 % от нативной плотности, так как объем сН3-группы (характерной поворачивающейся единицы, см. рис.
18-1) составляет ≈ 20 % объема аминокислотного остатка. В результате зависимость суммарной свободной энергии F = E – TSот плотности глобулы проходит через максимум («барьер» #), отделяющий нативную(плотноупакованную) глобулу N от любого более рыхлого денатурированного состояния D. Из-за этого барьера денатурация белка и происходит по типу «все-или-ничего»,независимо от дальнейшего состояния денатурированной молекулы.253а его фазовый, кооперативный характер связан с тем, что боковые группыприкреплены к главной цепи и не могут раскрепощаться поодиночке. до открытия расплавленной глобулы денатурация белков обычно трактовалась как полное разрушение структуры и переход глобулы в клубок.После этого открытия стало ясно, что денатурированный белок можетбыть как довольно плотным, так и рыхлым в зависимости от силы растворителя и гидрофобности цепи.
Оценки показывают, что поры расплавленной глобулы (поры, необходимые для свободы движений боковых групп)заполнены растворителем, так как перенос молекулы воды в пору внутри белка термодинамически выгоден по сравнению с существовавшимтам до того вакуумом. На опыте об этом свидетельствует ничтожность изменения парциального объема при денатурации белка. Но проникающемувнутрь растворителю, если только он не слишком сильно притягиваетсяпорами (ведь они окружены в основном неполярными группами, слабопритягивающими воду), удастся только заполнить пόры уже существующие (необходимые для свободы движений боковых групп), но не удастсясоздать новые (уже не необходимые для этих движений и «нужные» лишьрастворителю), т.
е. не удастся разорвать оставшиеся в белке взаимодействия. тогда он не сможет расширить глобулу — как вода не может растворить губку, хоть и заполняет ее пόры, — и денатурированный белоктак и останется компактной расплавленной глобулой (причем «мокрой»,насыщенной растворителем расплавленной глобулой).Внутренний голос: Если Вы говорите – «мокрой», то должна быть ещеи «сухая» расплавленная глобула?Лектор: да. Это – глобула, пóры в которой не заполняются водой.такая глобула (так же, как и «мокрая») была, из теоретическихсоображений, предсказана А. В. Ф. и Е.
И. Шахновичем в 1980-х годах,но анализ теоретических и экспериментальных данных показал, чтосухая расплавленная глобула менее стабильна, чем мокрая, и потомуменьше подходит на роль интермедиата плавления белка. Однако совсемнедавно сухая расплавленная глобула была обнаружена (Jha & Udgaonkar, Proc. Natl. Acad. USA (2009) 106:12289–12294) при флуктуациях,предшествующих плавлению белка. компактность расплавленной глобулы обеспечивается остаточными гидрофобными взаимодействиями.
Они не очень сильны. дажев расплавленной глобуле апомиоглобина, обладающей развитойвторичной структурой и почти нативной топологией укладки большейчасти цепи (Jennings & Wright, Science (1993) 262:892–896), остаточныевзаимодействия гидрофобных боковых групп по крайней мере втри раза слабее, чем в нативном белке (Samatova et al., Protein Sci.254(2009) 18:2152–2159), а у некоторых таких групп эти остаточныевзаимодействия и вовсе отсутствуют (что подчеркивает неоднородностьрасплавленной глобулы). Если же остаточные гидрофобные взаимодействия слабы, т. е.
если растворитель сильно притягивается к пόрамв белке, то он начинает расширять пόры, глобула начнет разбухать,и тем сильнее, чем сильнее притяжение растворителя к белковой цепи,т. е. чем меньше выгоды находят звенья цепи в контакте друг с другом.По мере роста притяжения растворителя к белковой цепи она разбухнетдо неупорядоченного клубка.При относительно низких температурах, когда роль энтропии раскрепощения боковых групп менее заметна и основная работа падаетна растворитель, клубок возникает непосредственно из нативной структуры (вспомните холодовую денатурацию).
При высоких же температурах он может, скорее, возникнуть после набухания расплавленнойглобулы (вспомните экспериментальную фазовую диаграмму танфорда;скоро я покажу вам ее опять).Набухание расплавленной глобулы, возможно, описывается классической теорией переходов глобула-клубок, иллюстрируемой рис. 18-4: еслибелковая цепь достаточно гидрофобна, денатурированный теплом белокостанется в состоянии расплавленной глобулы; если недостаточно — оннабухнет или (если растворитель «лучше» или цепь менее гидрофобна)вообще полностью развернется.Рис. 18-4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
