А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 48
Текст из файла (страница 48)
рис. 17-1) и при добавлении в растворденатурантов типа мочевины (NH 2 — CO — NH2) или гуанидингидрохлорида([(NH2)3C]+Cl– ) — эти вещества оттягивают к себе водородные связи O-атомовводы, нарушают баланс водородных связей в ней, и тем самым заставляют ее активнее рвать такие связи в белке.
денатурируют белки и при добавлении в раствормолекул додецилсульфата натрия (чьи гидрофобные хвосты проникают в ядробелка и ломают его), различных спиртов, солей и т. д., а также — сверхвысокихдавлений.Интересно, что белки существ, обитающих в экстремальных (для нас!) условиях типа горяче-кисло-соленых источников, являются «экстремофилами»:они существуют в нативной форме именно при таких экстремальных условиях,а при «физиологических» (для большинства организмов) условиях денатурируют.следует отметить, что в архитектурах белков-экстремофилов нет никаких яркихособенностей, отличающих их от «обычных» («мезофильных») белков, а адаптация к экстремальным условиям обеспечивается «неяркой» подгонкой первичныхструктур, направленной на усиление тех взаимодействий, что могут поддержатьстабильность пространственной структуры при заданных внешних условиях.Впрочем, рассказ об этом увел бы нас далеко в сторону… Может ли денатурированный белок ренатурировать и обрести свою нативную структуру? то есть, обратима ли его денатурация?232Да (это известно со времен опытов Анфинсена в 1960-х гг.; кстати, за нихон получил Нобелевскую премию), если белок не слишком велик и не подвергался сильной химической модификации после сворачивания in vivo:тогда «мягко» (без разрыва цепи) разрушенная температурой, денатурантоми т.
д. архитектура белка спонтанно восстанавливается при «нормализации»среды. Правда, эффективная ренатурация in vitro нуждается в тщательномподборе экспериментальных условий, иначе ей может воспрепятствоватьвыпадение из раствора и/ или агрегация (межмолекулярная, а для большихбелков, видимо, и внутримолекулярная агрегация отдаленных кусков цепи:известно, что способность к ренатурации и ее «выход» обычно падают,а экспериментальные сложности — растут с увеличением размера белка).Обратимость денатурации белка чрезвычайно важна: она показывает,что вся нужная для создания уникальной нативной структуры белка информация находится в его аминокислотной последовательности, а сама нативная структура белка (строго говоря: не модифицированного небольшого белка) равновесна и стабильна; и эта обратимость позволяет применятьтермодинамику для описания и изучения такого перехода. тот фундаментальный факт, что денатурация белка происходит как переход типа «все-или-ничего», был показан П.
Л. Приваловым, работавшимв нашем Институте белка. Он изучал тепловую денатурацию белка, которая обычно сопровождается большим тепловым эффектом, ~1 ккал / мольаминокислотных остатков. как доказать, что плавление белковой молекулы — переход типа«все-или-ничего»? для этого недостаточно показать существование пикатеплоемкости (или, что есть то же самое, что энергия белка S-образно зависит от температуры).
Все это свидетельствует только о резкости перехода, о том, что он охватывает много аминокислотных остатков одновременно, но ничего не говорит о том, плавится ли белок целиком или по частям.Чтобы доказать, что плавление белка — переход типа «все-или-ничего»,нужно сравнить (1) «эффективную теплоту» перехода, вычисляемуюиз его ширины, с (2) «калориметрической теплотой» этого перехода, т. е.с количеством тепла, поглощаемым одной молекулой белка в процессеплавления. совпадение этих двух независимых величин показывает,что молекула плавится как единое целое.Это и есть «критерий Вант-Гоффа» для наличия перехода типа«все-или- ничего».
Ввиду его важности рассмотрим этот критерий внимательно.«Эффективная теплота» перехода, следующая из его ширины, естьколичество тепла, поглощенного одной независимой «единицей плавле-233ния». Если эффективная теплота перехода меньше калориметрической —«единица плавления» меньше, чем сама молекула, т. е. молекула плавитсяпо частям.
Если эффективная теплота перехода больше калориметрической, то «единица плавления» больше молекулы, т. е. плавится не одна молекула белка, а какой-то их агрегат.как связана эффективная теплота перехода с его шириной? рассмотрим«единицу плавления», которая может находиться в двух состояниях: «твердом», с энергией Е и энтропией S, и «расплавленном», с энергией Е΄ и энтропией S΄. Пусть, для простоты, Е, Е΄, S и S΄ не зависят от температуры Т (рассмотрение более общего случая я предоставляю читателю…).так как состояний — всего два, то из формулы Больцмана легко видеть, что вероятность пребывания «единицы плавления» в расплавленномсостоянии есть Pраспл = exp [– (Е΄– TS΄) / kT] / {exp [–(Е — TS) / kT] + exp [– (Е΄– TS΄) / kT]} == 1 / {exp [(∆Е — T∆S) / kT] + 1},(17.1)где ∆Е = Е΄ – Е, ∆S = S΄– S. Вероятность пребывания «единицы плавления»в твердом состоянии есть (для перехода «все-или-ничего») PтВ = 1 – Pраспл..Производная dPраспл./ dT показывает, как быстро меняется Pраспл.
с температурой. Простое вычисление (с использованием уже известной нам формулы d (F / T) / dT = d [(E – TS) / T] / dT = –E / T2) показывает, чтоdPраспл./ dT = Pраспл. (1 – Pраспл.) (∆E / kT2).(17.2)Пожалуй, надо расписать здесь все преобразования подробнее, чтобыне принимать на веру, а понимать.
Обозначим (∆E — T∆S) / kT через X. тогда dX / dT = –∆E / kT2, Pраспл. = 1 / (eX + 1), Pтв = 1 – Pраспл. = eX / (eX + 1), и dPраспл./ dT = d [1 / (eX + 1)] / dT = –[1 / (eX + 1)2] [deX / dT] == — [1 / (eX + 1) 2] eX [dX / dT] = –[1 / (eX + 1)] [eX / (eX + 1)] [dX / dT] == Pраспл. (1 – Pраспл.) (–dX / dT) = Pраспл.
(1 – Pраспл.) (∆E / kT2).точка середины перехода Т0 = ∆E / ∆S. В этой точке Pраспл. = Pтв = 1 / 2,и здесь величина Pраспл. (1 – Pраспл.) проходит через максимум, равный 1 / 4.точка самого быстрого изменения P распл., т. е. максимум производнойdPраспл./dT тоже падает практически на температуру Т0, если ∆E/kT >> 1, т.
е.если переход происходит в узкой области. Здесь наклон кривой Pраспл. (Т)максимален и равен(dPраспл./ dT)|T = To = (1 / 4) ∆E / kT02.(17.3)Графическое определение ширины перехода показано на рис. 17-3, слева. Оно делается путем линейной экстраполяции максимального наклона234кривой Pраспл. (Т) до пересечения с базовыми прямыми, соответствующиминативному (Pраспл. = 0) и денатурированному (Pраспл.
= 1) состояниям. В зонеперехода экстраполированная (штриховой линией) величина Pраспл. |экстрап.меняется от 0 до 1 (то есть ∆P распл. | экстрап. = 1), а температура меняетсяна ∆T. Значит(dPраспл./ dT) |T = To = ∆Pраспл. |экстрап./ ∆T = 1 / ∆Т,— т. е. ∆Т определяется (см. рис. 17-3) зоной самого крутого подъемавеличины Pраспл., или, в общем виде, шириной зоны резкого изменениялюбого экспериментального параметра, определяющегося вероятностьюрасплавленного состояния (например, шириной зоны резкого измененияспиральности белковой цепи).В окончательной форме связь эффективной теплоты плавления «плавящейся единицы» ∆E с шириной ∆T и температурой T0 перехода имеет вид1 / ∆T = (1 / 4) ∆E / kT02, или∆E = 4kT02 / ∆T.(17.4)рассчитанная таким образом — только из наблюдаемой формы перехода — теплота ∆E денатурации «единицы плавления» сравниваетсяс калориметрической теплотой плавления целого белка (рассчитываемойкак ∆H / N, где ∆H — количество тепла, поглощенного всеми имеющимисяв калориметре N молекулами белка, причем N = m / M, где m — масса имеющегося в пробирке белка, а M — его молекулярный вес).
Если∆E = ∆H / N(17.5)— значит плавление целого белка является переходом типа «все-или- ничего». Это и есть «критерий Вант-Гоффа».Если ∆E < ∆H / N (т. е. если ширина перехода ∆T больше, чем того требует критерий Вант-Гоффа) — то «единица плавления» меньше, чем весьбелок, т. е. он плавится по частям. Если ∆E > ∆H / N — то «единица плавления» больше белка, т. е. плавится как целое не одна молекула белка,а какой-то белковый агрегат. разрушение структуры белка при повышении температуры — плавление — выглядит естественно; однако существует и «холодовая» денатурация белка при аномальном понижении температуры (рис.
17-4). Правда,для многих белков такая денатурация не наблюдается, так как вода в приборе успевает замерзнуть раньше…трудами лаборатории Привалова, где «холодовая» денатурация былавпервые обнаружена на опыте, было показано также, что она, как и обычная тепловая денатурация, происходит как переход типа «все-или-ничего».235аРис. 17-4. Обратимая «холодовая» денатурация белка (апомиоглобина) при аномальном понижении температуры (нижняя кривая; стрелка показывает, что температура в ходе опыта понижается). Верхняя кривая показывает ренатурацию белка(левый пик) при обратном повышении температуры и его дальнейшую тепловуюденатурацию (правый пик). кривые относятся к избыточной теплоемкости раствора белка по сравнению с теплоемкостью растворителя; они не отнормированына количество белка в растворе.
картинка, с небольшими изменениями, взятаиз Yu. V. Griko, P. L. Privalov, S. Yu. Venyaminov & V. P. Kutyshenko, J. Mol. Biol.(1988) 202:127–138Причина «холодовой» денатурации (тут я привожу аргументы Брандтса,предсказавшего ее задолго до опытов Привалова и Грико) кроется в том,что гидрофобные взаимодействия, которые держат белок компактным, сильнорастут с температурой, т. е. сильно падают с ее понижением. рост гидрофобных эффектов — и, в частности, их энергии — с температурой проявляетсяв относительно высокой теплоемкости денатурированного, менее компактного состояния белка (см.
∆Cpd на рис. 17-2). В результате теплота плавлениябелка сильно растет с температурой и падает с понижением температуры(рис. 17-2, 17-5а). Падает до того, что может изменить знак при низких температурах (рис. 17-5а)! то есть, если обычно более упорядоченная структура(нативный белок) имеет более низкую энергию, чем менее упорядоченная (денатурированный белок) — то при аномально низких температурах(~10 °с и ниже) энергия нативного белка (плюс энергия окружающей еговоды) может быть выше, чем денатурированного. то же самое, однако, происходит и с энтропией денатурации: она, как и положено энтропии гидрофобного эффекта, тоже падает с падением температуры.
В результате стабильностьбелка (разность свободных энергий его нативной и денатурированных форм)проходит через максимум при «комнатных» или нулевых температурах и начинает падать при более значительном охлаждении (рис. 17-5б). При этоминогда стабильность белка падает до того, что при аномально низкой (с точкизрения физиологии: ~0 °с и ниже) температуре белок разваливается. Правда,обычно дело до этого не доходит, так как вода с белком замерзает, и все процессы крайне замедляются (что позволяет хранить белок на холоде).236бРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
