А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Я буду говорить только о водорастворимых глобулярных белках. самоорганизация мембранных белковизучена еще сравнительно мало, и о них я скажу буквально пару слов. самоорганизация фибриллярных белков изучена лучше, но скорее не на физическом, а на биохимическом уровне (она уже обсуждалась на примереобразования коллагена). В живой клетке белок синтезируется на рибосоме. Биохимический синтез белковой цепи занимает порядка минуты, да и все изготовление «готового», свернутого белка, занимает примерно столько же — экспериментне видит разницы (для справки: весь жизненный цикл бактерии можетдлиться всего пару десятков минут). Поэтому естественно предположить,что сворачивание белка может начинаться еще на рибосоме, еще до окончания ее полного синтеза всей белковой цепи.к сожалению, достоверные экспериментальные данные об образовании белковой структуры in vivo — в клетке — весьма скудны: очень263трудно увидеть структурные превращения растущего белка на фоне всегоклеточного супа.
Обычно приходится останавливать синтез, выделять «недоделанный» белок, исследовать его отдельно — на все уходит время, десятки минут, в течение которых пространственная структура исследуемойбелковой цепи может кардинально измениться…ряд такого рода опытов с большими белками показывает, что их первые, N-концевые домены успевают свернуться (или, точнее, учитывая длительность самого опыта, обладают способностью свернуться) еще до окончания полного синтеза цепи.Здесь, однако, надо подчеркнуть, что все эти данные относятся к многодоменным белкам; это существенная оговорка, так как «единицей самоорганизации», по-видимому, является не белок в целом, а его отдельный домен.то есть «полусвернутый» домен не наблюдается, и мы не можем сказать,что сначала сворачивается его N-концевая половина, потом — с-концевая.О том, что домен является единицей сворачивания, свидетельствуютдва ряда данных, полученных, правда, не in vivo, а in vitro: во-первых, отдельно взятые домены часто способны к правильной самоорганизации;во-вторых, однодоменный белок, лишенный примерно десятка аминокислот на своем с-конце, к самоорганизации не способен.
с другой стороны,А. А. комаром с соавторами было показано, что цепь глобина, синтезируемая в бесклеточной системе, способна связать гем, когда рибосомой изготовлено только чуть больше половины этой цепи. [Глобин — однодоменный белок, судя и по его структуре, и по характеру его плавления in vitro(т. е. его денатурация протекает по типу «все-или-ничего»).
Однако егоN-концевая половина образует компактный субдомен, в котором находятсясвязывающие гем участки цепи.]ряд интересных данных по сворачиванию белков получен в бесклеточной белок-синтезирующей системе (т. е. не совсем in vivo, но и не совсем in vitro).такая система состоит из рибосом, транспортных и информационных рНки других факторов, необходимых для матричного синтеза белковой цепи.Здесь уместно отметить, что, говоря об эксперименте “in vivo” и “in vitro”,физики и биологи часто имеют в виду разные вещи, так как между чистым “invivo” (в организме) и чистым “in vitro” («в стекле») есть много допускающихдвоякое толкование ступеней. Например, сворачивание белка в бесклеточной системе (со всеми ее рибосомами, факторами инициации и терминации, шаперонамии т.
д.) — это столь же явно эксперимент “in vivo” с точки зрения физика (для которого in vitro — это отдельный белок в растворе; а бесклеточная система… —уж больно много здесь жизненных реалий!), сколь явно он является экспериментом“in vitro” с точки зрения биолога (для которого “in vivo” — это в живом и желательно неповрежденном организме). Однако структурное, например, исследование отдельного белка в организме практически невозможно. так что на практике всегдаидут на разумный компромисс — на приближение биологически интересного явления in vivo доступным экспериментальному наблюдению явлением in vitro.264к сожалению, и в бесклеточной системе очень трудно увидеть строениерастущего белка на фоне громадной рибосомы.
Строение, действительно,увидеть трудно. Но, если повезет, можно увидеть активность вновь синтезированного белка.счастливой находкой здесь оказалась люцифераза: этот белок, приняв свою нативную конформацию, катализирует реакцию с испусканиемсвета. так что появление нативной люциферазы легко увидеть — ведьбольше в клетке ничего не светится. Исследуя биосинтез и сворачиваниеэтого белка, В. А. колб, Е.
В. Макеев и А. с. спирин в нашем Институтебелка рАН показали, что первый активный белок появляется через 10 минпосле включения его биосинтеза, а выключение, блокирование биосинтезанемедленно прекращает выход активного белка (рис. 19-1). Это значит,что уже синтезированных, но еще не свернувшихся цепей люциферазыпрактически нет — т. е. мы видим, что сворачивание этого большого, содержащего свыше 500 остатков в цепи белка идет либо котрансляционно,либо почти мгновенно после конца биосинтеза.Правда, недавно сделанные эксперименты (Eichmann et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA (2010) 107:9111–9116) показывают, что не до конца синтезированная рибосомой белковая цепь не образует определенной пространственной структуры ни вися на рибосоме, ни будучи освобожденной отнее (что, в принципе, не противоречит образованию этой цепью расплавленной глобулы).
таким образом, не до конца синтезированная рибосомойбелковая цепь in vivo ведет себя так же, как укороченная на несколькос-концевых аминокислот цепь in vitro: она не образует определеннойтрехмерной структуры.Рис. 19-1. свечение нативной люциферазы, синтезируемой в бесклеточной системе. Время«0» — включение биосинтеза люциферазы. Время выключения биосинтеза указано стрелкой.сразу после этого свечение прекращает свойрост, т. е.
выход нового активного белка большене наблюдается. картинка, с небольшими изменениями, взята из V. A. Kolb, E. V. Makeev &A. S. Spirin, EMBO J. (1994) 13:3631–3637 Однако для выяснения не только результата, но и хода процесса самоорганизации приходится исследовать самоорганизацию белка «совсем invitro» (без всяких рибосом, шаперонов и т. д.), т.
е. при ренатурации белкав растворе.265Около 1960 г. было сделано замечательное открытие: глобулярный белок способен к спонтанной самоорганизации in vitro (ренатурации), еслипосле биосинтеза он не подвергся сильной химической модификации.В этом случае его архитектура, «мягко» (без разрыва цепи) разрушенная температурой, растворителем и т. д., спонтанно восстанавливаетсяпри «нормализации» среды.
Правда, эффективная ренатурация нуждаетсяв тщательном подборе экспериментальных условий, иначе ей может воспрепятствовать агрегация белка.Внутренний голос: А не сохраняется ли в денатурированном белкекаких-то унаследованных от нативного состояния пространственных структур, которые могли бы направить его сворачивание на правильный путь?Лектор: Если белок денатурирован «как следует», то нет. конечно,если вы не оставите в денатурированном белке его интактные S–S-связи,а разорвете их; и если вы выждете несколько минут, достаточных для исчезновения памяти о нативной форме cis- и trans-пролинов. И если выпоместите белок в достаточно сильный денатурант, где он превратитсяв клубок (где его вторичная структура разрушится, а объем увеличитсяна порядок, т.
е. все дальние по цепи контакты в цепи тоже пропадут).Внутренний голос: Однако ведь есть вполне надежные сведения о существовании заметного числа «нативных» контактов между не-соседнимипо цепи остатками даже во вполне развернутом белке!Лектор: Есть такие данные.
Правда (если оставить в стороне белкис S–S-связями), они касаются контактов между довольно близкими остатками, разделенными в цепи всего несколькими другими. И основной вопрос (в свете того, что мы сейчас обсуждаем) заключается вот в чем: этиконтакты — они что, унаследованы от нативной структуры белка и заморожены, или же они просто время от времени спонтанно образуются в развернутой цепи? к сожалению, ЯМр (а именно он, в основном, и видит обсуждаемые контакты) не может различить «замороженные» контакты от тех,что образуются время от времени.
дело в том, что сигнал ЯМр спадаеткак R–6 (где R — контактное расстояние), так что один и тот же сигнал соответствует контакту c R = 4,5 Å, существующему 100 % времени, и контактуc R = 3,0 Å, существующему 10 % времени. Я лично полагаю, что наблюдаемые контакты не заморожены (если это, конечно, не ковалентные S–S-связи;но о них мы сейчас и не говорим). Я не вижу никакой физической причиныдля этого. Я полагаю, что обсуждаемые контакты просто часто образуютсямежду притягивающимися кусочками цепи (напомню, что именно такие,притягивающиеся кусочки в основном и контактируют в нативном белке).то же относится, по-видимому, и к «остаточной» вторичной структуре развернутых цепей, которую порой видит кд.266 Явление спонтанной самоорганизации белков было открыто в группеАнфинсена в 1961 г. Открыто на примере спонтанного восстановлениябиохимической активности и «правильных» S–S-связей в бычьей рибонуклеазе А — после ее полного разворачивания с разрывом всех S–S-связейи последующего помещения в «нативные» условия.
Это открытие, впоследствии подтвержденное на множестве других белков, а также возможность чисто химического синтеза белковой цепи, спонтанно сворачивающейся далее в активный белок (опыты Меррифилда и др.), позволяетв первом приближении отделить изучение структурообразования белкаот изучения биосинтеза белковой цепи. самоорганизация белка in vitro может рассматриваться как самый простой (и поэтому для меня, физика, наиболее интересный) случай «чистой»самоорганизации, когда белку не помогает никто.Вообще, самоорганизация пространственных структур белков (а такжерНк) — уникальное физическое явление, не имеющее аналогов в «неживой» природе.
Эта самоорганизация напоминает образование кристаллов — но кристаллов, во-первых, не имеющих периодической пространственной структуры; во-вторых, чрезвычайно сложно устроенных; и,наконец, очень маленьких.самоорганизация белковых структур относится, с физической точкизрения, к классу явлений «возникновение порядка из порядка» (по классификации Пригожина): трехмерный «апериодический кристалл» (говоря словами Шредингера) структуры белка порождается заранее фиксированнымпорядком звеньев в его цепи. Видимо, следует сразу отметить, что самоорганизация трехмерной структуры белков (и рНк, и кристаллов вообще)возникает из стремления молекул к термодинамическому равновесию,и тем принципиально отличается от той самоорганизации типа «порядокиз беспорядка» (будь то самоорганизация в осциллирующей химическойреакции Белоусова—жаботинского или самоорганизация в экологическойсистеме «хищник—жертва»), которую обычно имеют в виду, говоря о самоорганизации в неравновесных, работающих на протоке энергии системах. Однако прежде, чем перейти к рассказу о самоорганизации белка invitro, к рассказу о физике этого спонтанного процесса, я хочу кратко упомянуть ту машинерию, которая используется клеткой для повышения эффективности самоорганизации белка.рибосома выдает белковую цепь постепенно и не вполне равномерно —есть паузы, приостановки биосинтеза цепи на «редких» (отвечающих «редким» в клетке трНк) кодонах.
Предполагается, что соответствие пауз границам структурных доменов способствует их спокойному созреванию.267далее. В клетке белковая цепь сворачивается под опекой специальных белков — шаперонов. Шапероны препятствуют агрегации белков. Многие из нихпродуцируются клеткой в ответ на тепловой шок, так как при повышениитемпературы возрастают вызывающие агрегацию гидрофобные силы.Агрегируя в клетке, белки часто образуют «тела включения». Белкине имеют там нативной структуры (в частности, там их S–S-связи завязаны беспорядочно).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
