А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Отсутствие интермедиатов при сворачивании этих белков регистрировалось по одинаковости скорости восстановления вторичной структуры, упаковки боковыхгрупп, флюоресценции триптофанов (зависящей от погруженности триптофанов в глобулу), по обмениваемости водородов в белке и т. д. Однако — что в таких экспериментах можно исследовать, чтобы пролить свет на природу процесса самоорганизации? Ведь интермедиатов,которые можно выделить и изучать, тут нет?!Ответ: здесь можно изучать переходное состояние — это «самое узкоеместо» на пути сворачивания белка.Я думаю, надо с самого начала сказать, что перехoдное состояние,играющее ключевую роль в кинетике процесса сворачивания и определяющее его скорость, является, по определению, абсолютно нестабильным,самым нестабильным состоянием на пути сворачивания.
таким образом,это — не какой-то из «интермедиатов сворачивания», о которых шла речьвыше (и, в частности, не расплавленная глобула!). те соответствуют минимумам свободной энергии; поэтому они стабильны хотя бы в течениекакого-то времени, т.
е. они могут накапливаться в процессе сворачивания,и их можно наблюдать непосредственно. Наоборот, перехόдное состояниесоответствует максимуму свободной энергии; поэтому оно не накапливается и не наблюдается непосредственно. Его можно наблюдать только по еговлиянию на скорость сворачивания.275Рис.
19-4. Одностадийная ренатурация ACBP (белка, связывающего ацил-коэнзимА), регистрируемая по восстановлению эллиптичности при 225 нм (а) и 286 нм (б);первое отражает восстановление вторичной структуры, второе — третичной (точнее, восстановление упаковки боковых групп). тонкая, ломаная линия — экспериментальный сигнал, жирная кривая — результат его сглаживания и экстраполяции,с учетом погрешности опыта. Обратите внимание на отсутствие изменений, происходящих за «мертвое время» опыта; оно свидетельствует, что за это время никакихинтермедиатов не образуется. картинки, с разрешения, взяты из Kragelund B.
B.,Robinson C. V., Knudsen J., Dobson C. M. & Poulsen F. M. Biochemistry (1995) 34:7217–7224. © 1995, ACS Отложим пока подробное описание исследования перехόдных состояний, наблюдаемых при сворачивании белков, и, забежав вперед, суммируем только его основной результат.В перехόдном состоянии очерчивается зародыш сворачивания белка,«ядро сворачивания» (рис.
19-5). В этом зародыше относительно небольшое число остатков цепи уже имеет свое нативное (т. е. такое же, как в нативном белке) расположение в пространстве и конформацию. В то же время остальные остатки остаются в денатурированной фазе.Более подробно мы рассмотрим все это на следующей лекции. до сих пор мы говорили только о водорастворимых глобулярных белках.действительно, огромное большинство исследований по сворачиваниюбелка были проведены на таких белках.
Но примерно треть белков в геноме каждого организма являются мембранными белками, которые могут достичь своего функционального состояния только в присутствии липидов.В настоящее время существуют данные в пользу того, что сворачиваниеспиральных мембранных белков проходит через промежуточные состояния,во многом похожие на расплавленную глобулу, наблюдаемую в водорастворимых глобулярных белках, т. е. имеющие нативоподобные вторичныеструктуры, но лишенные упорядоченности взаимодействий в простран-276Рис. 19-5. Экспериментально очерченное ядро сворачивания белка CheY, согласноLόpez-Hernándes & Serrano, Folding & Design (1996) 1:43–55.
Входящие в ядросворачивания остатки изображены черными кружками на фоне нативной укладкицепи. серыми кружками изображены не вовлеченные в ядро сворачивания остатки. Без шариков оставлены те области цепи, где мутации еще не делались. крестами помечены два сложных для экспериментальной интерпретации остатка цепиственной структуре. Присутствие гидрофобных остатков, выступающихиз плотных расплавленных глобул, делает их весьма привлекательнымив контексте сворачивания в мембране. ряд опытов заставляет полагать,что разные спирали в мембранных белках сворачиваются более или менееавтономно, что совместимо с гибкостью, ожидаемой для расплавленнойглобулы. Аналогия между сворачиванием мембранных и водорастворимых белков, возможно, распространяется на существование структурного«ядрышка», которое может служить их зародышем сворачивания.
другиемембранные белки, порины, имеющие структуру типа β-бочонка, сворачиваются, по-видимому, значительно более кооперативно, чем спиральныемембранные белки, т. е. в их сворачивании не просматривается четких стадий и стабильных интермедиатов. Прогресс в области исследования сворачивания белков, помимо удовлетворения нашего естественного любопытства, будет, безусловно, способствовать нашей способности эффективно экспрессировать как водорастворимые глобулярные, так и мембранные белки, и повысит наше пониманиерегуляции внутриклеточных, секреторных и мембранных процессов. В заключение этой лекции представляется нелишним провести некуюаналогию между самоорганизацией белков и самоорганизацией вирусов.В оболочечных белках многих простых вирусов, по-видимому, имеютсявсе свойства, необходимые для формирования готовых вирусных частиц.277Однако для более сложных вирусов известно, что пути их сборки включают в себя «леса» — белки или другие компоненты, необходимые для формирования вирусных частиц, но не включающиеся в зрелые вирионы.
Эти«молекулярные шапероны» поистине замечательны как с точки зренияструктуры, так и с точки зрения механизма сборки. Любопытно следующее. так как простые вирусы собираются без накопления интермедиатов(точно так же, как простые белки сворачиваются без накопления частично свернутых состояний), то мы накопили гораздо больше информациине о фундаментальных путях сборки простых вирусов (и белков), а о болеесложных путях сборки сложных вирусов (а равно и белков), так как здесьчастично структурированные частицы могут наблюдаться при подходящихусловиях.Лекция 20Одностадийное сворачивание малых белков. теория переходныхсостояний. Экспериментальный поиск и изучение нестабильныхпереходных состояний в сворачивании белка.
Ядро сворачиваниянативной структуры белка. Его экспериментальное обнаружениеin vitro методами белковой инженерии. Нуклеационный механизмсворачивания белка.как уже говорилось на прошлой лекции, важнейшую роль в пониманиисворачивания белков сыграло изучение простейшего случая самоорганизации белка — случая, когда по ходу сворачивания не происходит накопления никаких метастабильных промежуточных состояний.Напомню, что некоторые из малых белков быстро сворачиваются —в «физиологических» условиях среды, моделируемых in vitro — без наблюдаемых, «накапливающихся» в эксперименте интермедиатов.
При этомпереход представляется происходящим в одну стадию, это регистрируетсяпо одинаковой скорости восстановления вторичной структуры, упаковкибоковых групп, флюоресценции триптофанов (зависящей от их погруженности в глобулу), по обмениваемости водородов в белке и т. д.стоит подчеркнуть, что одностадийной кинетики сворачивания близточки де / ренатурации белка можно a priori ожидать для всех однодоменных белков, исходя из того, что термодинамика их де- и ренатурации соответствует, как известно, переходу типа «все-или-ничего», т.
е. отсутствиюсколько-нибудь заметного количества «полусвернутых» форм. Не тривиально только то, что это одностадийное сворачивание относится — для некоторых небольших белков — также и к далеким от равновесия «физиологическим» условиям, где скорость сворачивания особенно велика и гдесворачивание большинства белков проходит через накапливающиеся интермедиаты типа расплавленной глобулы.Именно в таком одностадийном сворачивании, происходящем в широком диапазоне внешних условий (и без осложняющих его анализ нака-278279пливающихся интермедиатов), наиболее удобно исследовать перехόдноесостояние — состояние, играющее ключевую роль в кинетике процесса. Вспомним, что переходное состояние соответствует максимуму свободной энергии на пути из одного стабильного состояния (минимума свободной энергии) к другому.Напомню также, что кинетика простейшего перехода между двумя непосредственно наблюдаемыми (стабильными) состояниями (А и В на рис.
20-1)успешно описывается теорией перехόдных состояний, которая в химииобычно называется теорией активированных комплексов.примерно 1013 с –1. (с такой частотой, под воздействием тепловых колебаний,молекула предпринимает попытки преодолеть активационный барьер #.)Однако нам часто будет удобнее (см. рис.
20-1б) рассматривать толькоустойчивые состояния (локальные минимумы свободной энергии на путиреакции), предполагая, что их свободная энергия много выше, чем и FA, и FВ. Напомню, что скорость и такого многошагового процесса (если число шагов не слишком велико) также определяется просто самым высокимбарьером на его пути.рассматривая многошаговой процесс, удобно1) принимать скорость элементарного шага равной скорости переходаиз одного минимума в другой, соседний:k0,step = k0,el exp (–δF / RT)Рис.
20-1. Преодоление свободно-энергетического барьера при переходе из стабильного состояния А в стабильное состояние В (стрелка слева) и из B в А (стрелкасправа). FA, FВ и F# — свободные энергии состояний А, В и «переходного» (барьерного, имеющего максимальную свободную энергию на пути процесса) состояния #. (а) Элементарная реакция. (б) Процесс, состоящий из нескольких элементарных переходов через устойчивые промежуточные состояния с высокой (выше,чем у А и В) свободной энергией. δF — подъем свободной энергии, который приходится преодолевать на одном шаге.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
