А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 61
Текст из файла (страница 61)
так как стабильность белка обычноотносят к чистой воде, то скорость разворачивания, измеряемую при высоких концентрациях денатуранта, обычно приходится экстраполироватьк низким его концентрациям.скорость сворачивания белка (перехода u → N) определяется (см. формулу (20.1)) разностью свободной энергии «зародыша» # и исходного развернутого U состояния белка (т. е.
величиной F# – Fu).Мутации влияют и на скорость сворачивания, и на стабильность белка.Это дает возможность использовать их для экспериментального определения формы зародыша нативной структуры белка.как же можно интерпретировать влияние мутаций на соотношениевеличин FN – Fu и F# – Fu в предположении о нуклеационном механизмесворачивания, заключающемся в том, что остатки — уж если они вовлеченыв зародыш нативной структуры — стоят там так же, как в нативном белке?существование нуклеации при сворачивании белка весьма правдоподобно, так как это сворачивание протекает как переход типа «все-или-ничего»(а это, как мы знаем, — микроскопический аналог фазового перехода первого рода в макроскопических системах).
Нуклеация типична для фазовыхпереходов первого рода (например, для кристаллизации).Об экспериментальной проверке этого предположения я расскажу вскоре.сначала я хочу рассказать, как величины FN – Fu и F# – Fu используются для того,чтобы очертить зародыш нативной структуры («ядро сворачивания»). Если мутация остатка так же влияет на величину F# – Fu, как она влияетна стабильность всего нативного состояния (т. е. на величину FN – Fu), —то это свидетельствует о том, что рассматриваемый остаток так же вовлечен в «зародыш» (образует там те же контакты, имеет ту же конформациюи т. д.), как он вовлечен в нативную глобулу.Если, наоборот, мутация остатка оказывает влияние только на стабильность белка (т.
е. на величину FN – Fu), но не на скорость сворачивания(т. е. она не влияет на величину F# – Fu), — значит, этот остаток не вовлекается в глобулярный «зародыш» сворачивания, т. е. он входит в нативнуюбелковую глобулу только уже после образования зародыша.И, наконец, если мутация остатка сильно влияет на стабильность белкаи слабее (но с тем же знаком) — на стабильность зародыша — значит, этотостаток либо входит в один из нескольких альтернативных зародышей,либо он образует в зародыше только часть тех контактов, которые имеетв нативном белке, т. е. лежит на поверхности зародышатак очерчивается зародыш сворачивания белка (рис.
20-6): для каждогоиз мутированных остатков цепи вычисляется величина289 Фf = ∆(F# – Fu) / ∆(FN – Fu)(20.8)— и, если для данного остатка Фf близка к 1, то говорят, что он входитв зародыш структуры; а если Фf близка к 0 — то нет.Рис. 20-6. структура переходного состояния белка CheY, согласно T. López-Hernándes& L.
Serrano, Folding & Design (1996) 1:43–55. На фоне нативной укладки цепи CheYчерными шариками выделены остатки, вовлеченные в структурированную частьпереходного состояния (имеющие Фf > 0,3, т. е. образующие там более 30 % своихнативных контактов), более светлыми шариками — не вовлеченные в структурированную часть переходного состояния остатки с Фf < 0,3. Без шариков оставлены теобласти цепи, где мутации еще не делались. крестами помечены два остатка, сложных для интерпретации, — у них столь малы (<< kT) величины ∆(F# – Fu) и ∆(FN –– Fu) (последнее важнее, так как эта величина стоит в знаменателе в формуле (20.8)),что погрешности в их определении превышают сами эти величиныЗамечательно, что лишь очень малое число остатков в белке не удаетсяпроинтерпретировать с такой точки зрения. (А с нее не удалось бы проинтерпретировать те остатки, что не вписывались в «нуклеационный механизм» сворачивания, т.
е. те остатки, мутации которых влияли бы толькона скорость сворачивания, но не на стабильность нативной структуры;или те, что стабилизировали бы только зародыш, но дестабилизировалинативный белок, и т. д. для этих остатков получались бы величины Фf >1и Фf < 0, что наблюдается крайне редко, и то, как правило, только тогда,когда погрешности в измерении ∆(F# – Fu) и особенно ∆(FN – Fu) велики.Это вселяет уверенность в том, что базовая картина, согласно которойостатки — уж если они вовлечены в зародыш — стоят там так же, как в нативном белке, — эта картина в основном справедлива. Подчеркиваю —в основном, но вряд ли полностью.
Появляются данные, что находящаясяв «переходном состоянии» белковая цепь более компактна, чем можнобыло бы ожидать для «нативоподобного кристаллика», окруженного клубком. Можно осторожно предположить, что «нативоподобный кристаллик»290переходного состояния окружен, по крайней мере в некоторых белках,чем-то вроде расплавленной глобулы. рисунок 20-6 показывает, что найденные описанным выше способом вбелке CheY остатки, наиболее существенные для сворачивания этого белка,группируются в компактный «доменчик», компактное ядрышко сворачивания, причем оно лежит не в геометрическом центре белка, а сдвинуто к егоповерхности. Аналогичная картина часто наблюдается и в других белках,исследованных на предмет местоположения их ядер сворачивания. Это показывает, что ядро сворачивания белка (folding nucleus) и его гидрофобноеядро (hydrophobic core) — вещи разные.
В ряде других белков наблюдаетсяочень «диффузное» – охватывающее большую часть белка, но слабо выраженное (характеризующееся низкими Φf величинами) и не имеющее четких границ ядро сворачивания. По-видимому, сворачивание этих белковидет многими параллельными путями через разные ядра сворачивания —что в эксперименте, который одновременно наблюдает за множествомсворачивающихся белков, и проявляется как слабо очерченное ядро.
такаяточка зрения подкрепляется тем, что некоторые введенные в эти белкимутации могут более четко локализовать ядро сворачивания, причем однимутации локализуют его в одном, а другие – в другом месте.Внутренний голос: Из того, что Вы сказали, следует, что любая мутация, влияющая на скорость сворачивания белка, должна влиять и на егостабильность.
Но есть эксперименты, показывающие обратное!Лектор: то, что я говорил, относится к переходам типа «все-или-ничего»,при которых нет накопления метастабильных «полусвернутых» состояний белковой цепи. Если такие промежуточные состояния присутствуют(что возможно только вдали от точки равновесия нативной и денатурированной форм белка, см. загиб кривой в самой левой части рис. 20-4 , а такжепрофиль свободной энергии на рис.
20-7), то мутация, не затрагивая стабильности нативного белка, может влиять на его метастабильное промежуточное состояние, и упомянутый Вами эффект — кстати, он и наблюдалсяв таких условиях — становится возможным. В заключение я хочу вернуться к рис. 20-4 и подчеркнуть, что дажедля совершенно конкретного белка не существует четко определенного«характерного времени сворачивания». действительно, этот рисунок показывает, что сворачивание лизоцима занимает порядка 0,1 с в нативныхусловиях и порядка 10 000 с в условиях созданного гуанидингидрохлоридом (при той же температуре раствора) равновесия нативной и денату-Рис. 20-7.
схема профиля свободной энергии для перехода из развернутого (U)состояния в нативное (N) через интермедиат (I), который стабилен (по сравнениюс U) в белке дикого типа (WT) и не стабилен в белке с мутацией, mut (что показано,в районе I, серой частью сплошной кривой и точечной кривой, соответственно);здесь предполагается, что мутация влияет только на интермедиат I.
В данном случае, сворачивание белка с мутацией происходит быстрее, так как этому белку ненадо выкарабкиваться из стабильного (по сравнению с U) интермедиата перед попаданием в лимитирующее скорость всего процесса переходное состояние #. Обратите внимание, что переход из U в N происходит в одну стадию (U→N) для белкас мутацией, где интермедиат I нестабилен по сравнению с исходным состоянием U(и, следовательно, не наблюдается), и в две стадии (U→I→N) для белка без мутации, где интермедиат I стабильнее, чем U. Однако повышение свободной энергиисостояния N (сближающее стабильность N со стабильностью U) дестабилизует состояние I и для белка без мутации (мысленно приподнимите немного кривую за ееправый край), и тогда переход в нем также протекает в одну стадию, U→Nрированной форм.
А в других условиях, при повышенной температуре,но без гуанидингидрохлорида, области равновесия этих форм отвечает (см.рис. 20-2) время сворачивания порядка 10 с. так что, обсуждая скоростьсворачивания белка, мы должны иметь в виду либо весь наблюдаемыйдиапазон времен сворачивания данного белка, либо совершенно конкретные экспериментальные условия, например, те условия, при которыхбелок сворачивается в клетке.292Лекция 21решение «парадокса Левинталя»: к стабильной структуре цепи автоматически ведет сеть быстрых путей сворачивания.
для этого необходимо только, чтобы между нативной укладкой цепи и прочими ееглобулярными укладками существовала бы заметная энергетическаящель. Обсуждение аномально медленного образования стабильнойструктуры в некоторых белках (серпины, прионы). Представлениеоб «энергетических ландшафтах» белковых цепей. Белковые структуры: физика самоорганизации и естественный отбор самоорганизующихся цепей.Мы продолжаем разговор о самоорганизации белков. Все экспериментальные данные, о которых я рассказывал, — сколь быинтересны они ни были сами по себе — не дают ответа на вопрос, как белок ухитряется найти свою нативную структуру среди астрономическогочисла возможных за те немногие секунды или доли секунды, что отпущены на его сворачивание.А число это — как я говорил, его оценил еще в 1968 г. сайрус Левинталь — действительно огромно: ~10100 возможных конформаций для цепииз 100 остатков; их «тупой» перебор занял бы ~1080 лет, кладя всего 10–13секунды на переход из одной конформации в другую.
А достаточно полный перебор конформаций, считал Левинталь, может быть только «тупым» — ведь белок может «почувствовать» стабильность конформации,только попав прямо в нее, так как отклонение даже на 1 Å может оченьсильно повысить энергию цепи в плотной белковой глобуле.«как же белок выбирает свою нативную структуру среди бесчисленногомножества возможных? — спросил Левинталь, и ответил: — По-видимому,самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному “путисворачивания”, и та структура, где этот путь заканчивается, и является егонативной структурой, вне зависимости от того, есть ли еще более стабильная укладка цепи, или нет». Иными словами, Левинталь предположил,293что нативная структура белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
