А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 59
Текст из файла (страница 59)
‡ — промежуточное состояние с максимальной, для устойчивого состояния, свободной энергией F‡суть ее сводится к тому, что скорость процесса лимитируется низкой населенностью переходного состояния #, т. е. наименее (по термодинамике)вероятного (и потому не накапливающегося и непосредственно не наблюдаемого), но необходимого промежуточного состояния пути из А в В, — или,иными словами, что кинетика переходов А→В (и В→А) определяется высотой максимума свободной энергии на пути, соединяющем А и В.При этом скорости перехода из А в B и из B в А, напомню, записываются в видеkА→В = k0 exp [– (F# – FA) / RT],kВ→А = k0 exp [–(F# – FВ) / RT]. (20.1)Здесь FA, FВ и F# — свободные энергии состояний А, В и «переходного» #(см. рис.
20-1), а k0 — скорость «элементарного шага» процесса.рассматривая элементарные реакции (рис. 20-1а), за k0 часто принимаютвеличину k0,el = RT / h (где h — постоянная Планка), равную (при T ~ 300 K)280(где δF — подъем свободной энергии, преодолеваемый в ходе элементарного шага);2) принимать за свободную энергию барьера величину F‡ — максимальную свободную энергию устойчивого промежуточного состоянияв этом процессе.тогдаkА→В = k0,el exp [–(F# – FA) / RT] = k0,el exp [–(F‡ + δF – FA) / RT] == k0,step exp [– (F‡ – FA) / RT].(20.2)Эта формула выглядит как (20.1) с заменой k0 → k0,step и F# → F‡.При этом характерное время перехода А→В естьtА→В = 1 / kА→В = (1 / k0,step) exp [+ (F‡ – FA) / RT].(20.2a)Эти же пояснения распространяются, естественно, и на tB→A и kВ→А.с этим уточнением уравнения (20.1) применимы к процессам, (а) протекающим за время, много большее, чем время элементарного шага,(б) состоящим из не слишком большого числа шагов и (в) не имеющимстабильных (накапливающихся) интермедиатов.
И именно с такими процессами мы имеем дело при сворачивании белков. Важно, что температурная зависимость скорости реакции А→В даетвозможность судить об энергии переходного состояния. для этого, согласно Аррениусу, вычисляют производную логарифма скорости реакциипо обратной температуре (1 / T):d [ln (kА→В)]/d (1 / T) = d [ln (k0,el) – (F#– FA) / RT]/(–T –2dT) ≈≈ –(E#– EA) / R.(20.3)281Здесь я воспользовался уже известной нам формулой d(F / T) / dT == –E / T 2 и пренебрег очень слабой зависимостью скорости элементарногошага k0,εl от температуры. Последнее допустимо даже в простых химических реакциях, и тем более допустимо в белках, где энергии E# и EA велики, так как определяются взаимодействиями множества частиц. рисунок 20-2 показывает изменение скорости сворачивания и разворачивания лизоцима при его тепловой ре- и денатурации.ния EN, но ниже энергии развернутого состояния Eu (последнее необычнодля химических реакций, где барьер по энергии выше, чем и начальное,и конечное состояния реакции).
дальнейший анализ этого графика [которыйтеперь берется в форме зависимости T ln (k / k0,el) от T] показывает, что такое же соотношение, Su > S# > SN, справедливо и для энтропий развернутого,переходного и нативного состояний при сворачивании белка. Это значит,что барьер между нативным и развернутым состояниями белка выглядит«обычным» энергетическим барьером — если глядеть на него со сторонынативного состояния, и что он выглядит необычным, энтропийным барьером — если глядеть на него со стороны развернутого состояния.Впрочем, этого можно было ожидать, исходя из сделанного на однойиз прошлых лекций анализа свободно-энергетического барьера и причинфазового, типа «все-или-ничего» перехода между нативным и денатурированным состоянием белка (рис.
20-3, который воспроизводит уже известную вам схему изменения энергии, энтропии и свободной энергии по мерерасширения глобулы).Рис. 20-2. Аррениусовы графики для зависимости скорости тепловой денатурациии ренатурации лизоцима от обратной температуры Т –1; графики извлечены из статьи S. Segava & S. Sugihara, Biochemistry (1984) 23:2473–2488. константы скоростиk измеряются в с–1.
ренатурация, скорость ku→N (эксперимент: точки o, и тонкаяинтерполяционная кривая); денатурация, скорость kN→u (эксперимент: точки •,и жирная интерполяционная кривая). середине плавления отвечает та температура, при которой ku→N = kN→u, т. е. где кривые пересекаются (около 1000 / 3,08 = 325к). При меньших температурах (т. е.
при больших Т –1, справа от точки пересечения) превалирует сворачивание, при бόльших температурах (т. е. при меньших Т–1,слева от точки пересечения) идет разворачиваниеОн показывает, что в самой середине перехода [там, где скорость сворачивания ku→N равна скорости разворачивания kN→u, так что кривые для lnku→Nи lnkN→u пересекаются] скорости обоих процессов близки к е–2.5≈ 0,1 с–1 (т. е.что здесь времена протекания и де-, и ренатурации — порядка 10 с).кроме того, эта картинка показывает, что денатурация ускоряетсяпо мере углубления в «область денатурации», а ренатурация ускоряетсяпо мере углубления в «область ренатурации».
И здесь содержится однаочень любопытная вещь.Она состоит в том, что скорость тепловой денатурации kN→u падает с Т –1(т. е. что она растет с температурой Т, что обычно для физико-химическихреакций), а скорость сворачивания ku→N — наоборот, растет с Т –1 (т. е. онападает с температурой, что необычно для физико-химических реакций).По формуле (20.3) это означает, что E# – EN > 0, а E# – Eu < 0. Иначе говоря,Eu > E# > EN, т. е.
энергия барьера E# лежит выше энергии нативного состоя-282Рис. 20-3. Изменение энергии E, энтропии S и свободной энергии F = E – TS с изменением плотности глобулы. D — денатурированное состояние (в данном случае — расплавленная глобула, так как плотность его велика), N — нативная глобула, # — «барьер», максимум свободной энергии на пути равномерного расширенияглобулы (от N к D). Обратимся еще раз к уравнениям (20.1). Они показывают, что отношение скоростей прямой и обратной реакций, kА→В / kВ→А есть просто константа равновесия между финальным В и начальным А состояниями КВ: А = kА→В / kВ→А = exp [– (FВ – FA) / RT].(20.4)283Величина этой константы равновесия, как известно, показывает то соотношение между финальным числом nB∞ молекул в состоянии В и финальным числом n A∞ молекул в состоянии А, к которому, в конечномитоге (при стремящемся к бесконечности времени наблюдения), приходит процесс при данных условиях (температуре и т.
д.), т. е. когда потокА→В уравновешивается потоком В→А, так что nА∞ kА→В = nВ∞ kВ→А: КВ: А = nB∞/ nА∞ = kА→В / kВ→А.(20.4a)с какой скоростью система приходит к этому равновесному состоянию? для ответа решим соответствующее дифференциальное уравнение:dnA/ dt = –kА→В nA + kB→A nB,(20.5)где t — время, а nA и nB — число молекул в состояниях A и B, соответственно (второе уравнение, для dnВ / dt, решать не надо, так как nA + nB ≡ n0,где n0 — полное число молекул, т.
е. dnВ / dt ≡ –dnА / dt).Подставляя в (20.5) nB = n0 – nA и используя то, что n0 kВ→А / (kА→В ++ kВ→А) = nА∞, согласно (20.4а), получаемdnA/ dt = – (kА→В + kВ→А) (nA – nА∞).Окончательный ответ — позвольте написать его без дальнейших выкладок,а вам рекомендуется сделать их самостоятельно — таков:nA(t) = [nA(0) – nА∞] exp [–(kА→В + kB→A) t] + nА∞.(20.6)Здесь nA(t) — число молекул в состоянии А в момент времени t от начала процесса, а nА∞ = n0 [kВ→А / (kА→В + kВ→А)] — конечное, равновесное числомолекул в состоянии А.Значит, видимая (apparent) скорость приближения к равновесию естьkapp = kА→В + kВ→А,(20.7)она равна сумме скоростей прямой и обратной реакций.Обратите внимание, что эта скорость kapp зависит только от условий,в которых протекает реакция, и не зависит от исходного распределениябелковых молекул между нативным и денатурированным состояниями[т.
е. от исходной доли nA(0)].В суммарной скорости kapp доминирует более быстрая реакция. Еслиусловия (температура и т. д.) отвечают большей устойчивости нативногосостояния, то в kapp = ku→N + kN→u доминирует ku→N — скорость сворачивания. Если более устойчиво денатурированное состояние, то в ku→N + kN→uдоминирует kN→u, скорость разворачивания.Большим преимуществом измерения скорости прихода к равновесиюkapp является то, что она всегда может быть измерена (в отличие от ku→N284и kN→u в отдельности), — как тогда, когда более стабильно нативное состояние, так и тогда, когда более стабильно денатурированное. При измерении kapp строятся так называемые «шевронные графики»(рис.
20-4). Они так называются из-за своей характерной V-образной формы, напоминающей шевроны на военных кителях. Один взгляд на этотграфик показывает, что скорости сворачивания ku→N и разворачивания kN→uзависят от концентрации денатуранта противоположным образом. с аналогичной ситуацией мы уже сталкивались, когда изучали температурнуюзависимость скоростей сворачивания и разворачивания белка. как и тогда,наблюдаемая здесь противоположность наклонов означает «промежуточность» свойств переходного состояния, их среднее положение междусвойствами нативного и развернутого белка.Рис. 20-4. «Шевронный график» зависимости k app = k u→N + k N→u, видимой характерной скорости приближения к равновесию между нативнойи развернутой формами белка (лизоцима куриного яйца), от концентрации гуанидингидрохлорида.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
